3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양
Summary
여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.
Abstract
성장, 증식 그리고 마지막의 연결을 차별화에 대한 3 차원 (3D) 공사장 공중 발판의 영향은 신경 장애 또는 neurodegenerative 질병에서 세포 기반 및 표준 치료에 대한 새로운 방법을 찾기 위해 큰 관심입니다. 3D 구조는 2D 문화보다 생체내 상황에 더 가까워지는 환경을 제공 것으로 예상된다. 재생 의료의 맥락에서 신경 줄기 및 전구 세포로 biomaterial의 공사장 공중 발판의 조합 치료 도구로 큰 약속을 보유하고 있습니다. 3 차원 환경을 에뮬레이션 1-5 문화 시스템과 줄기의 다양한 유형의 증식과 분화에 영향을 표시되었습니다 전구 세포. 여기에, 3D – microenviroment의 형성과 functionalisation가 포함된 세포의 생존과 운명을 결정하는 것이 중요합니다. 6-8 여기 PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), 펩타이드 기반 히드로겔 발판을 사용잘 설명하고 다른 세포 유형에 3D – 환경의 영향을 연구하는 데 사용되는. 7,11-14 PuraMatrix 쉽게 사용자 정의와 나노 섬유의 합성 제조 어느 높은 신뢰성의 3D 문화 시스템을 제공 수 또한 외부의 자유입니다.
최근 우리는 발판의 형성에 대한 PM – 농도의 영향을 연구했습니다. 본 연구에서는 13 PM의 사용 농도는 원자 힘 현미경에 의해 입증되었다 3D 구조의 형성에 직접적인 영향을 미쳤다. hNPCs의 생존과 분화의 후속 분석은 내장 세포의 운명에 대한 PM의 사용 농도의 영향을 밝혔다. 그러나, immunofluorescence 기법의 posses 어떤 장애물에 의해 생존의 연결이나 분화의 분석. 신뢰할 수있는 데이터를 얻으려면 하나는 예의 상대 번호를 얻기 위해 매트릭스 내에서 세포의 총 수를 결정한다. βIII – tubulin에 의한 표시의 연결을 세포. 이 전제 조건이 표본의 Z – 스택을 취할 수 형광 현미경과 같은 공촛점 현미경 또는 유사한 기술의 모든 3 차원에있는 공사장 공중 발판을 분석하는 기술. 또한 이러한 종류의 분석은 매우 시간이 소요됩니다.
여기 유동세포계측법하여 나중에 분석 예에 대한 3D – 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에서는 ReNcell VM 셀 라인의 인간 신경 전구 세포 (hNPCs) (Millipore 미국)가 교양되었으며 laminin (PML)과 보충 PuraMatrix (PM) 또는 PuraMatrix 구성 3D – 공사장 공중 발판으로 차별. 우리 손에 0.25 %의 PM – 농도 그러나 농도가 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다. 12이 출시 세포 유동세포계측법 예를 들면 immunocytochemical 연구에 사용되며 이후 분석할 수, 세포 13 재배를위한 최적했습니다. 분석 및 MO,이 속도데이터의 신뢰성을 향상보다 기본에, 얻은 데이터 휴식을 통해 다시.
Protocol
Discussion
3D – 공사장 공중 발판의 사용은 세포 배양 상황에 가까이 생체내 상황에서 다른 세포 유형의 개발을 연구하는 기회를 제공합니다. 그러나, 예를 들어의 연결을 차별하거나 한 세포 유형의 예 부량에 대한 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 몇 가지 장애물을 극복하기 위해이 기능 연구의 분석에 관한.
여기 발판 PuraMatrix 및 FACS 또는 기능 assays 같은 도구에 쉽게 액세스를 제?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 자신의 우수한 기술 지원 노먼 크루거 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Bioscience | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Roth | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | Gibco | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
References
- Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).
- Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine. Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).
- Blow, N. Cell Culture: building a better matrix. Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).
- Hauser, C. A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials. Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).
- Teng, Y. D. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).
- Silva, G. A. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science. 303, 1352-1355 (2004).
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).
- Taraballi, F. Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures. Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).
- Zhang, S. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).
- Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration. PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).
- Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro. Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).
- Ortinau, S. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).
- Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).
- Morgan, P. J. Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine. Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).
- Giese, A. K. Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells. BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).
- Schmöle, A. C. Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells. Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).
- PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).
