Summary

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

Published: January 11, 2012
doi:

Summary

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

Abstract

성장, 증식 그리고 마지막의 연결을 차별화에 대한 3 차원 (3D) 공사장 공중 발판의 영향은 신경 장애 또는 neurodegenerative 질병에서 세포 기반 및 표준 치료에 대한 새로운 방법을 찾기 위해 큰 관심입니다. 3D 구조는 2D 문화보다 생체내 상황에 더 가까워지는 환경을 제공 것으로 예상된다. 재생 의료의 맥락에서 신경 줄기 및 전구 세포로 biomaterial의 공사장 공중 발판의 조합 치료 도구로 큰 약속을 보유하고 있습니다. 3 차원 환경을 에뮬레이션 1-5 문화 시스템과 줄기의 다양한 유형의 증식과 분화에 영향을 표시되었습니다 전구 세포. 여기에, 3D – microenviroment의 형성과 functionalisation가 포함된 세포의 생존과 운명을 결정하는 것이 중요합니다. 6-8 여기 PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), 펩타이드 기반 히드로겔 발판을 사용잘 설명하고 다른 세포 유형에 3D – 환경의 영향을 연구하는 데 사용되는. 7,11-14 PuraMatrix 쉽게 사용자 정의와 나노 섬유의 합성 제조 어느 높은 신뢰성의 3D 문화 시스템을 제공 수 또한 외부의 자유입니다.

최근 우리는 발판의 형성에 대한 PM – 농도의 영향을 연구했습니다. 본 연구에서는 13 PM의 사용 농도는 원자 힘 현미경에 의해 입증되었다 3D 구조의 형성에 직접적인 영향을 미쳤다. hNPCs의 생존과 분화의 후속 분석은 내장 세포의 운명에 대한 PM의 사용 농도의 영향을 밝혔다. 그러나, immunofluorescence 기법의 posses 어떤 장애물에 의해 생존의 연결이나 분화의 분석. 신뢰할 수있는 데이터를 얻으려면 하나는 예의 상대 번호를 얻기 위해 매트릭스 내에서 세포의 총 수를 결정한다. βIII – tubulin에 의한 표시의 연결을 세포. 이 전제 조건이 표본의 Z – 스택을 취할 수 형광 현미경과 같은 공촛점 현미경 또는 유사한 기술의 모든 3 차원에있는 공사장 공중 발판을 분석하는 기술. 또한 이러한 종류의 분석은 매우 시간이 소요됩니다.

여기 유동세포계측법하여 나중에 분석 예에 대한 3D – 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에서는 ReNcell VM 셀 라인의 인간 신경 전구 세포 (hNPCs) (Millipore 미국)가 교양되었으며 laminin (PML)과 보충 PuraMatrix (PM) 또는 PuraMatrix 구성 3D – 공사장 공중 발판으로 차별. 우리 손에 0.25 %의 PM – 농도 그러나 농도가 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다. 12이 출시 세포 유동세포계측법 예를 들면 immunocytochemical 연구에 사용되며 이후 분석할 수, 세포 13 재배를위한 최적했습니다. 분석 및 MO,이 속도데이터의 신뢰성을 향상보다 기본에, 얻은 데이터 휴식을 통해 다시.

Protocol

1. 제 1 부 : PuraMatrix에 hNPCs의 문화 laminin 무허가 0.25 %의 PuraMatrix 농도와 발판의 세대 사전에 다음과 같은 솔루션을 준비 필요 20 %의 자당 및 멸균 증류수에 용해 10 % 자당을 포함하는 솔루션을 포함하는 솔루션을 준비합니다. 1.5 ML 원뿔 튜브에 증류수 120 μl와 20 %의 자당 솔루션의 해결 방법 1 혼합 120 μl하십시오. 1.5 ML 원뿔 튜브에 20 % 자당 용액 60 μl로 PuraMatrix 솔루?…

Discussion

3D – 공사장 공중 발판의 사용은 세포 배양 상황에 가까이 생체내 상황에서 다른 세포 유형의 개발을 연구하는 기회를 제공합니다. 그러나, 예를 들어의 연결을 차별하거나 한 세포 유형의 예 부량에 대한 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 몇 가지 장애물을 극복하기 위해이 기능 연구의 분석에 관한.

여기 발판 PuraMatrix 및 FACS 또는 기능 assays 같은 도구에 쉽게 액세스를 제?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 자신의 우수한 기술 지원 노먼 크루거 감사하고 싶습니다.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
PuraMatrix peptide hydrogel BD Bioscience 354250  
Mouse laminin I Cultrex 400-2009090  
Sucrose Sigma S9378-1KG  
Normal goat serum Dako X0907  
Triton X 100 Roth 3051.3  
PBS Dulbecco Biochrom AG L 1825  
HBSS Gibco 14170-088 Hanks’ Balanced Salt Solution 1X
βIII-tubulin antibody Santa Cruz Sc-51670 Mouse, monoclonal, 1:500
Alexa Fluor 488 Invitrogen A 11029 Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 568 Invitrogen A 11031 Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 647 Invitrogen A 21235 Goat α mouse, 1:1000
Mowiol 4-88 Reagent Calbiochem 475904  
Dabco Aldrich D2,780-2 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98%
Cell strainer BD Biosciences 352350 70 μm pore size
Saponin Merck 7695  
Trypsin/ EDTA GIBCO 25300-054  
Benzonase 250 U/μl Merck 1.01654.0001  
Trypsin Inhibitor Sigma T6522 (500 mg)  
20% HSA Octapharma Human-Albumin Kabi 20%  

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Cite This Article
Liedmann, A., Rolfs, A., Frech, M. J. Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel. J. Vis. Exp. (59), e3830, doi:10.3791/3830 (2012).

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