Summary
在这里，我们描述了自组装的三维支架文化人类神经祖细胞的使用。我们提出了一个协议，以流式细胞仪分析后如释放支架的细胞。该协议可能会调整到其他类型的细胞，进行详细的机械研究。
Abstract
3维（3D）棚架上生长，增殖和最后的神经元分化的影响是极大的兴趣，以便找到细胞为基础的，规范化的治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的新方法。预计三维结构提供了一个环境更接近体内的情况比2D文化。在再生医学的背景下，生物材料支架与神经干细胞和祖细胞的组合持有作为一种治疗工具的巨大潜力。1-5文化系统模拟三维环境的影响在不同类型的干细胞增殖和分化，并已被证明祖细胞。在这里，3D -微环境的形成和functionalisation重要的是要确定嵌入细胞的生存和命运。6-8在这里，我们用PuraMatrix 9,10（RADA16下午），基于一种多肽水凝胶支架，这是很好的描述和用于研究不同类型的细胞上的3D环境的影响。7,11-14 PuraMatrix可定制容易制造的纳米纤维的合成提供了一个高可靠性的三维培养体系，这此外，异种自由。
最近，我们研究形成的脚手架上的PM浓度的影响，在这项研究中13 PM的使用浓度上形成的三维结构，这是由原子力显微镜表明了直接影响。一个随后的生存和分化的hNPCs分析显示嵌入式细胞的命运时所使用的浓度的影响。然而，生存或免疫荧光技术具有一些障碍，神经元分化的分析。为了获得可靠的数据，来判断一个矩阵内的细胞总数获得的相对数，如。 βIII-微管蛋白标记的神经细胞。这是先决条件的技术来分析，共聚焦显微镜或荧光显微镜能够采取标本Z -栈一样可比技术在所有3个维度的支架。此外，这种分析是极其耗费时间。
在这里，我们展示了一个方法，为以后的分析，如流式细胞仪从三维棚架细胞释放。在这个协议中培养人类神经祖细胞ReNcell VM细胞株（hNPCs）（美国Millipore公司），并在三维支架组成PuraMatrix（下午）或与层粘连蛋白（PML）的补充PuraMatrix有区别的。在我们的手上了0.25％的PM浓度是最适合培养细胞 13，但浓度可能会调整到其他类型的细胞。12可用于释放的细胞如免疫细胞化学研究，并随后通过流式细胞仪分析。这加快了分析和Mo重新结束后，获得的数据的其余部分更广泛的基础，提高数据的可靠性。
Protocol
1。第1部分：PuraMatrix hNPCs文化
- 在棚架与PuraMatrix无层粘连蛋白之一的0.25％浓度的代需要提前准备以下的解决方案
- 准备的解决方案，其中包含20％的蔗糖和解决方案，含10％蔗糖溶于无菌蒸馏水。
- 对于解决方案1 120μL与120μL蒸馏水1.5毫升的锥形管20％的蔗糖溶液混合。
- 解决方案2混合60μL60μL20％蔗糖溶液1.5毫升的锥形管PuraMatrix解决方案。
对于棚架制备的补充与层粘连蛋白（8微克每100μL矩阵）需要准备以下的解决方案的0.25％PuraMatrix浓度。
- 对于解决方案1混合72μl与20％的蔗糖溶液和120μL48μL层粘连蛋白在1.5 ml锥形管蒸馏水的。
- 对于解决方案2混合60μL60μL在20％的蔗糖溶液1.5毫升的锥形管PuraMatrix解决方案。
- 对于细胞埋设在PuraMatrix准备4孔细胞培养板，放在一个消毒的玻璃盖玻片在两口井（直径13毫米）。存放在以后使用洁净工作台板。玻璃盖玻片仅用于免疫细胞化学研究。如果没有免疫细胞化学染色法的目的是，这一步可以跳过。
要准备封装在一个三维支架hNPCs已经准备了以下解决方案。 Benzonase胰蛋白酶/ EDTA溶液稀释，使用稀释倍数的1:10.000。对于Trypsin-Inhibitor/Benzonase解决方案组合：DMEM/F12 + Benzonase25U/μl+ 1％的人血清白蛋白胰蛋白酶抑制剂（0.5mg/ml的）。
- 分离细胞，加入500μL胰蛋白酶/ Benzonase的解决方案，并培育孵化器5分钟（37 ° C，5％ CO 2）。停止Trypsin-Inhibitor/Benzonase解决方案的反应。随后5分钟3000 × G.离心分离细胞5毫升10％的蔗糖溶液冲洗细胞，再次离心。弃上清。
- 重悬细胞，10％的蔗糖溶液中，最后一个单元格的解决方案应包含1 × 10 6细胞/ ml 。
接下来的步骤，1.8至1.11，应尽可能快地完成，因为PuraMatrix解决方案，这可能是对细胞有害的低pH值。
- 混合60微升的细胞悬浮液1。
- 新增120溶液1μL，含有细胞，锥形管与溶液2，仔细混合。
- 居住在4孔板，将100μL的混合物在每个盖单。
- 慢慢200μL细胞培养液中添加每孔2-3分钟后，另一200μL。这将启动自组装矩阵。
- 孵育彗星英语学习者在37 ° C，对于在一个加热板或受热面积您的洁净工作台洁净工作台1H。尽可能不动的板块，因为这可能会损害组装矩阵。
- 除去大部分中等，但不是所有的，以避免落入矩阵干1000μL移液器，。加入500μL介质洗为10分钟的矩阵。最后取出介质，并加入500μl新鲜培养基和地方培养板在培养箱（37℃，5％的CO 2） 。由于矩阵敏感休克板块应该是不太尽可能移动和存储在一个单独的孵化器，如果可能的话，。
- 这里使用hNPCs的激增为7天，在三维支架和撤出生长因子13开始分化。换液，每2-3天。
2。第2部分：整个矩阵的免疫细胞化学染色
- 提前染色过程需要准备：AB锁定缓冲溶液组成的5％正常山羊血清和0.3％TRITON X - 100的PBS，4％多聚甲醛溶液，0.1 M的PBS溶解，如果需要的话，解决方案与4“Diamidin - 2 ,6 -'- phenylindoldihydrochlorid（ DAPI）为原子核含有100毫微克的DAPI /毫升溶解在PBS染色。样品安装Mowiol和DABCO的混合物。
- 洗矩阵删除1000μL移液器培养基，用PBS洗5分钟的棚架一次。
- 要修复支架取出PBS和添加多聚甲醛400μL（4％）在0.1 M PBS，每孔孵育30分钟，在室温下的矩阵。固定支架，可存储在PBS数周长达数月的0.02％NaN的3在4 ° C的补充。
- 在染色之前，用PBS洗5分钟支架。
- 阻断缓冲液孵育的支架。封闭液改变了3次，每次2-3小时，subsequently支架封闭液孵育过夜4 ° C。
- 取出阻塞的缓冲溶液和添加PBS溶解，辅以1％正常山羊血清抗体孵育过夜的矩阵在4 ° C。
- 删除主抗体溶液和洗支架在夜间4次，2小时，随后在4 ° C与PBS。
- 取出PBS和添加与二级抗体溶液，溶解在PBS辅以1％正常山羊血清，室温在黑暗中为4 h。
- 4-6次为1小时，随后在夜间在4 ° C黑暗环境中，用PBS清洗样品。
- 对于核染色，可以加入400μL为30分钟的DAPI解决方案。
- 要安装一个需要显微镜玻片样品。在显微镜幻灯片，添加50μLMowiol / DABCO。从4孔板取出盖玻片，并把他们精心安装介质。
- 在这里，我们使用了Biozero 8000显微镜（KEYENCE，德国，卡尔斯鲁厄）获得单显微照片和Z -栈。每个堆栈包含30 1-2微米的距离的单一图片。模糊固有荧光，使用相应的分析仪软件被删除之前的Z -栈生产的完整的预测。
3。第3部分：流式细胞仪分析棚架推出hNPCs
- 提前从支架的细胞释放洗用500μl的HBSS的支架。
- 转让1000μL移液器15毫升含有细胞培养液的锥形管的支架。
- 破坏支架，机械悬浮细胞溶液1000μL移液器多次，随后离心5分钟在3000 XG的解决方案。
- 用吸管取出上清液，加入500μL胰蛋白酶/ Benzonase解决方案和悬浮细胞沉淀数次。
- 细胞孵育5分钟在37 ° C在胰蛋白酶/ Benzonase解决方案。停止反应，添加1毫升Trypsin-inhibitor/Benzonase溶液和吸管上下几次。
- 3000 XG的细胞悬液，离心5分钟，去除上清，用2毫升的HBSS缓冲细胞。重复此步骤两次。此过程将删除矩阵碎片。
- 通过细胞悬浮液通过一个删除聚合，收集细胞，在细胞培养液中中的细胞过滤器（孔径70微米）。如膜片钳或fluometric测量功能研究的盖玻片上再次获得的细胞可以接种。要处理流式细胞仪检测细胞，立即修复细胞（见4.1）。
4。第4部分：βIII-微管蛋白的阳性细胞，流式细胞仪定量
- 修正释放的步骤3.7在室温下15分钟获得1％的煤灰的细胞。
- 细胞悬液，离心5分钟在3000 XG和去除电子商务的上清液。如果需要的话，细胞可以准备在4℃保存以供日后分析。因此在洗涤缓冲液（PBS 0.5％BSA和0.02％钠叠氮化补充）悬浮细胞。
- 350 XG，如果要进行流式细胞仪准备，细胞悬液，离心10分钟，弃上清，并在25μL抗体溶液重悬细胞。因此，第一抗体混合皂甙的缓冲区，在浓度为1:100，例如βIII-微管蛋白。皂苷的缓冲区，由皂甙浓度为0.5％，一个BSA的浓度为0.5％和0.02％的叠氮化钠浓度的PBS。
- 细胞悬液，孵育一抗室温在摇床2小时。准备无第一抗体作为阴性对照样本。
- 对于第一次洗涤步骤加入300μl皂素缓冲直接的细胞。的细胞悬液，离心5分钟，在350 × G.对于第二个清洗步骤，弃上清，加入300μl缓冲和5分钟的细胞悬液离心350 × G.
- 去除上清，加入25μL溶液中含有二级抗体（例如，1:1000的Alexa Fluor 647，溶解在皂素缓冲）。在黑暗中，在室温下的二级抗体1H孵育细胞。
- 对于第一次洗涤步骤加入300μl皂素缓冲直接的细胞。的细胞悬液，离心5分钟，在350 × G.对于第二个清洗步骤，弃上清，加入300μl缓冲和细胞悬液，离心5分钟，在350 × G.
- 弃上清，重悬细胞，流式细胞仪分析500μL洗涤缓冲。
5。代表性的成果
在自组装水凝胶支架PuraMatrix培养hNPCs的一个例子是如图1所示。 hNPCs成长圈状结构，在未修改下午。在这种文化条件S，细胞难以在透射光的认可，虽然捆领域之间的过程是可见的（图1A）。根据所用的细胞类型的培养条件下，可修改矩阵，如添加层粘连蛋白。对于HNPC细胞株ReNcell VM（Millipore公司）层粘连蛋白是必要的，以诱使不太密集的总量的增长模式，但更均匀分布的细胞（图1B）。独立的修改，该矩阵可以用来研究如神经元分化。图1C提出了染色的神经元标记βIII-微管蛋白的hNPCs。在这个例子中的细胞生长矩阵中的7天，其后分化为4天，其中被撤出的生长因子EGF和碱性成纤维细胞生长因子13的胞体和密集网络的进程，建立由细胞诱导分化，可公认的容易。然而，很明显，细胞数量的量化大量耗时，矩阵的不同区域的照片进行分析，以获得可靠的数据的基础上进行了统计分析。在图1D，人们可以看到细胞从基质释放，其后于盖玻片制地图的一个例子。这些细胞可能用于功能研究。
三维支架的细胞释放提供的可能性来分析不同的参数，如标志蛋白的表达或AnnexinV / PI染色或TUNEL法检测细胞存活率。图2显示了一个βIII-微管蛋白+细胞的百分比的流式细胞仪分析的一个例子。阴性对照组（不βIII-微管蛋白标记的细胞），如图2a所示。这些控件用来确定βIII-微管蛋白+细胞后检测门（图2b）。图2c所示的细胞人工计数和流式细胞仪分析比较。 βIII-微管蛋白+细胞的百分比是determ独立非执行董事通过计算细胞总数（核DAPI染色）βIII-微管蛋白+细胞中的荧光图片。
图1。在自组装肽水凝胶PuraMatrix hNPCs培养。）hNPCs PuraMatrix封装（下午）增长球形，密集的包装结构，球的直径可高达几百微米。在这两者之间的领域之一，可以识别细胞（箭头）建立起来的进程捆绑。二）封装在PuraMatrix细胞与层粘连蛋白（PML）生长在较致密的结构，更均匀分布的补充。在补充基质可以识别单个细胞密度较低的地区（箭头）层粘连蛋白，但它几乎是不可能量化的细胞数量。三）hNPCs区别像βIII-微管蛋白（绿色）在PML的表达神经元标记为4天。为了evaluaTE的一个类似的DAPI核染色（蓝色），以确定细胞总数的阳性细胞百分比。显微呈现的Biozero - 8000显微镜拍摄的照片的Z - Stack的投影。 D）从矩阵释放的细胞可以接种如盖玻片，为进一步功能研究。显微图像显示三维培养细胞，随后释放过程。 βIII-微管蛋白染色（红色），揭示了细胞在三维支架主持可比形态。
图2。流式细胞仪分析细胞释放PuraMatrix。为了克服时间消耗我们使用的一个协议释放PuraMatrix访问快流式细胞仪分析培养细胞的显微定量。一）未染色细胞作为阴性对照，为随后的分析门（黑框）例如βIII-微管蛋白的细胞。二）为了量化阴性对照组，同门，βIII-微管蛋白+细胞的百分比。阳性细胞出现在正确的X轴，哪里还观察中间人口（点帧），最有可能代表细胞碎片。三）手工计数细胞和细胞计数流式细胞仪比较，发现阳性细胞的比例要高得多，其中βIII-微管蛋白的数量的时间依赖性+相媲美，表明了流式细胞仪协议的可靠性。
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Discussion
使用三维支架提供学习的机会，发展不同类型的细胞在细胞培养的情况下更接近体内的情况。然而，就如神经元分化或功能的研究，人们必须克服一些障碍，以获得可靠的数据类型的细胞，例如量化分析。
在这里，我们描述了基于脚手架PuraMatrix，并随后在2D情况，流式细胞仪或功能分析提供一个易于访问工具的研究使用的细胞释放的多肽水凝胶的hNPCs文化。最近，我们展示了3D支架形成原子力显微镜和细胞的生存和分化的影响PuraMatrix 浓度的影响 ，13然而，人要记住，不同的细胞类型，可能需要不同的文化条件或其他材料组成的矩阵，例如matrigEL或胶原蛋白。
释放细胞的协议是基于18的制造商提供了一个协议，协议，用来准备主要是由消化酶等物质，对周围由一个细胞的机械隔离如神经文化相媲美。细胞容忍这种程序和保持至关重要，建立了流程，如βIII微管蛋白表达神经元标记，一旦他们再次接种于层粘连蛋白涂层的表面。在这里，我们与释放细胞进行流式细胞仪研究，以量化βIII-微管蛋白+细胞的数量。做“手动”显微细胞计数在一个量化的比较，揭示了βIII-微管蛋白 +细胞的比例要高得多。这是最有可能是由于较高的人工分析比较流式细胞仪（50.000％探头）（每探头几个百）计数细胞数量的。然而，＆B的动力学ETA III -微管蛋白+细胞遵循相同的模式在这两个样本，我们发现时间βIII-微管蛋白+细胞减少。这是根据使用的ReNcell VM细胞的研究。15-17其他障碍需要克服在手动分析是难以分析的矩阵或在一个“真正的基体材料的高背景”低估造成非常密集的地区细胞数量。我们相信，这个协议可以适应其他类型的细胞，提供快速和可靠的方法来量化几个方面的增殖，分化或细胞的生存。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢他出色的技术支持，克鲁格诺曼。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Biosciences | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Carl Roth Gmbh | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck & Co., Inc. | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck & Co., Inc. | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
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