Summary
Здесь мы опишем использование самоорганизации 3-мерные эшафот к культуре человеческих нервных клеток-предшественников. Мы представляем протокол выпустить из клетки строительные леса, которые будут проанализированы в дальнейшем, например, с помощью проточной цитометрии. Этот протокол может быть адаптирован и к другим типам клеток проводить детальный механистически исследований.
Protocol
1. Часть 1: Культура hNPCs в PuraMatrix
- Заранее поколения эшафот с PuraMatrix концентрации 0,25% без ламинин нужно подготовить следующие решения
- Подготовка раствора, содержащего 20% сахарозы и раствора, содержащего 10% сахарозы, растворенный в дистиллированной воде.
- Для решения 1 смеси 120 мкл 20% раствора сахарозы с 120 мкл дистиллированной воды 1,5 мл коническую трубку.
- Для решения 2 смесь 60 мкл PuraMatrix решение с 60 мкл 20% раствора сахарозы в 1,5 мл коническую трубку.
Для подготовки эшафот с PuraMatrix концентрации 0,25% дополнена ламинин (8 мкг в 100 мкл Матрица) необходимо подготовить следующие решения.
- Для решения 1 смесь 72 мкл дистиллированной воды с 120 мкл 20% раствора сахарозы и 48 мкл ламинин в 1,5 мл коническую трубку.
- Для решения 2 смесь 60 мкл раствора PuraMatrix с 60 мкл 20% раствора сахарозы в 1,5 мл коническую трубку.
- Для заливки ячеек в PuraMatrix подготовить 4-а культура клеток пластине и месте стерилизовать скольжения покровного стекла (диаметр 13 мм) в двух скважинах. Храните пластины в чистом столе для дальнейшего использования. Стеклянная крышка скользит будут использованы только для иммуноцитохимического исследований. Если нет иммуноцитохимического окрашивания предназначены, шаг может быть пропущен.
Для подготовки hNPCs для инкапсуляции в 3D одна лесов необходимо подготовить следующие решения. Развести Benzonase в трипсина / ЭДТА решения, используя коэффициент разбавления 1:10.000. Для Trypsin-Inhibitor/Benzonase смешивать раствор: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + трипсин-ингибитор (0.5mg/ml).
- Отсоедините клетки путем добавления 500 мкл трипсина / Benzonase раствора и инкубировать 5 мин в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2). Остановить реакцию с Trypsin-Inhibitor/Benzonase решение. Впоследствии центрифуги отдельные клетки в течение 5 мин при 3000 х g. Вымойте клеток с 5 мл 10% раствора сахарозы и центрифуга снова. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 10% раствор сахарозы, окончательное решение клетка должна содержать 1х10 6 кл / мл.
Следующие шаги, от 1,8 до 1,11, должно быть сделано как можно быстрее, из-за низкого рН раствора PuraMatrix, которые могут быть вредными для клеток.
- Смешать 60 мкл клеточной суспензии с раствором 1.
- Добавить 120 мкл раствора 1, содержащий клетки, в конической трубе с раствором 2 и тщательно перемешать.
- Разместить 100 мкл смеси непосредственно на каждой крышки скользит проживал в 4-луночного планшета.
- Медленно добавьте 200 мкл среды культуры клеток на лунку и через 2-3 минут еще 200 мкл. Это будет инициировать самосборки матрицы.
- Инкубируйте слоктя при 37 ° С, в течение 1 ч в чистом столе на тарелку отопления или отапливаемой площади вашей чистой поверхности. По возможности не перемещайте пластину так как это может повредить монтаж матриц.
- Удалите большую часть среды, но не все, чтобы избежать падения матриц сухой, с 1000 мкл пипетки. Добавить 500 мкл среды мыть матриц в течение 10 мин. Наконец удаления средних и добавить 500 мкл свежей среды и места культуры пластины в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2). Как матрицы чувствительны к удару пластин должна быть перенесена как можно меньше и хранится, если это возможно, в отдельном инкубаторе.
- Здесь используется hNPCs были распространились в течение 7 дней в 3D-строительные леса и дифференциация была инициирована выводом факторы роста 13. Средний меняли каждые 2-3 дня.
2. Часть 2: Иммуноцитохимическая окрашивание целых матриц
- Заранее окрашивания процедуру нужно подготовить: абблокировка буферного раствора, состоящего из 5% нормальной козьей сывороткой и 0,3% Тритона Х-100, растворенных в PBS, 4% параформальдегида решение, основанное на 0.1 М PBS и, если необходимо решение с 4 ',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid ( DAPI) для окрашивания ядер, содержащих 100 нг DAPI / мл, растворенный в PBS. Образцы были смонтированы смесью Mowiol и DABCO.
- Для мытья матриц удалить среды с 1000 мкл пипетку и промыть леса с PBS один раз в течение 5 минут.
- Чтобы исправить лесов удалить PBS и добавьте 400 мкл параформальдегида (4% в 0,1 М PBS) в каждую лунку и инкубировать матриц в течение 30 минут при комнатной температуре. Исправлена Строительные леса могут быть сохранены в PBS дополнен с 0,02% NaN 3 на 4 ° С в течение нескольких недель до нескольких месяцев.
- В преддверии окрашивания вымыть леса с PBS в течение 5 минут.
- Инкубируйте лесов в блокировании буферного раствора. Блокировка решение было изменено в три раза через каждые 2-3 часа и subsequвидимому леса инкубировали в блокировании решения в течение ночи при 4 ° C.
- Удалите блокирующий буферный раствор и добавить первичного антитела, растворенных в PBS с добавлением 1% нормальной козьей сывороткой и инкубировать матриц в течение ночи при 4 ° C.
- Удалить первичную решение антител и мыть леса 4 раза в течение 2 ч, а затем в течение ночи при 4 ° С с PBS.
- Удалить PBS и добавьте раствор с вторичными антителами, растворенного в PBS с добавлением 1% нормальной козьей сывороткой, в течение 4 ч при комнатной температуре в темноте.
- Вымойте образцов с PBS 4-6 раз в течение 1 ч, а затем в течение ночи при 4 ° С в темноте.
- Для окрашивания ядер можно добавить 400 мкл раствора DAPI в течение 30 мин.
- Чтобы установить образцы нужны предметные стекла. Добавить 50 мкл Mowiol / DABCO на предметные стекла. Снимите крышку ускользает из 4-луночный планшет и положил их аккуратно на монтажной средой.
- Здесь мы использовали Biozero 8000микроскопа (Keyence, Германия, Карлсруэ), чтобы получить одну микрофотографии и Z-стеки. Каждый стек содержит 30 отдельных изображений с расстояния в 1-2 мкм. Использование соответствующего программного обеспечения анализатор размытия присущие флуоресценции был удален до полного проекции Z-стеки были произведены.
3. Часть 3: Выпуск hNPCs от лесов для анализа потока цитометрии
- Заранее выпуске клетки лесов мыть леса с 500 мкл HBSS.
- Передача лесов с помощью 1000 мкл пипетки на 15 мл коническую трубку среде, содержащей культуру клеток.
- Чтобы сорвать леса механически ресуспендирования клетка решение несколько раз с 1000 мкл пипетки, а затем центрифуги решения при 3000 мкг в течение 5 мин.
- Удалить супернатант с пипетки, добавьте 500 мкл трипсина / Benzonase решения и ресуспендируют осадок клеток в несколько раз.
- Инкубируйте клетки в течение 5 минпри 37 ° С в Трипсин / Benzonase решение. Чтобы остановить реакцию добавьте 1 мл раствора и Trypsin-inhibitor/Benzonase пипетку вверх и вниз несколько раз.
- Центрифуга клеточной суспензии 5 мин при 3000 мкг, удалите супернатант и промыть клетки с 2 буфером HBSS мл. Повторите этот шаг в два раза. Эта процедура удаления матрицы мусора.
- Pass решение клеточной суспензии корыта ячейки фильтра (размер пор 70 мкм), чтобы удалить агрегаты и собирать клеток в клеточной среде культуры. Полученные клетки могут быть посеяны еще раз, например, на обложке квитанции для функциональных исследований, а зажим патч или fluometric измерений. Для обработки клеток для проточной цитометрии, зафиксировать клетки немедленно (см. 4.1).
4. Часть 4: Количественная оценка βIII-тубулина положительных клеток с помощью проточной цитометрии
- Fix выпущен клеток, полученных в шаге 3,7 с 1% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 3000 мкг и removэлектронной супернатант. При необходимости клетки могут быть готовы хранить при температуре 4 ° С для последующего анализа. Поэтому ресуспендирования клеток в промывочный буфер (PBS дополнен с 0,5% БСА и 0,02% Na-азид).
- Для продолжения подготовки к проточной цитометрии, центрифуги клеточной суспензии в течение 10 мин при 350 мкг, отбросить супернатант и ресуспендирования клеток в 25 мкл раствора антител. Поэтому первый антител смешивают с сапонин буфера в концентрации 1:100 например βIII-тубулина. Сапонин буфер состоит из PBS с сапонин концентрации 0,5%, концентрация БСА на 0,5% и Na-азид концентрации 0,02%.
- Инкубируйте клеточной суспензии с первого антитела в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере. В качестве отрицательного контроля подготовки образца без первых антител.
- Для первого шага стиральной добавить 300 мкл буфера сапонин непосредственно к клеткам. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 350 х г. Для второго этапа стирки, отказаться отсупернатант, добавьте 300 мкл буфера и центрифуги клеточной суспензии в течение 5 мин при 350 х г.
- Удалить супернатант и добавить 25 мкл раствора, содержащего вторичные антитела (например, Alexa Fluor 647, 1:1000, растворенного в сапонин буфера). Инкубируйте клетки с вторичными антителами 1 час при комнатной температуре в темноте.
- Для первого шага стиральной добавить 300 мкл буфера сапонин непосредственно к клеткам. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 350 х г. Для второго этапа стирки, отказаться от супернатант, добавьте 300 мкл буфера и центрифуги клеточной суспензии в течение 5 мин при 350 х г.
- Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 500 мкл промывочного буфера для анализа проточной цитометрии.
5. Представитель Результаты
Примером hNPCs культивировали в самоорганизации гидрогеля эшафот PuraMatrix показано на рисунке 1. HNPCs расти в сферические структуры, как в неизмененном PM. В этой культуре условиемс, клетки едва ли может быть признано в передаче света, хотя пучков процессов между сферами видны (рис. 1А). В зависимости от условий культивирования используемого типа клеток, матрица может быть изменена, например, путем добавления ламинин. Для hNPC клеточной линии ReNcell В.М. (Millipore) ламинин необходимо, чтобы побудить модель роста с менее плотных агрегатов, но и более однородное распределение клеток (рис. 1б). Независимо от модификации, матрица может быть использована для изучения, например, нейронных дифференциации. Рис 1С представляет окрашивание hNPCs для нейронный маркер βIII-тубулина. В этом примере Клетки выращивались в течение 7 дней в матрице и впоследствии дифференцированные в течение 4 дней, где дифференциация была вызвана выводом ЭФР факторов роста и bFGF. 13 тел клеток и густая сеть процессов застроена клетки могут быть признал легко. Тем не менее, очевидно, что количественная оценка количества клеток занимает много времени, так как большое количествофотографии разных регионах матрица должна быть проанализирована, чтобы получить надежную базу данных для статистического анализа. В 1D рис можно увидеть пример клетки освобождаются от матрицы, а затем сплетши на обложке скользит. Эти клетки могут быть использованы для функциональных исследований.
Освобождение клетки от 3D-строительные леса дает возможность проанализировать различные параметры, такие как выражение маркер белки или выживаемость клеток AnnexinV / PI окрашивание или анализа TUNEL. На рисунке 2 показан пример анализа проточной цитометрии процент βIII-тубулина + клеток. Отрицательного контроля (клетки не отмеченные для βIII-тубулина) показан на рисунке 2А. Эти элементы управления используются для определения ворота для последующего обнаружения βIII-тубулина + клеток (рис. 2В). Сравнение ручного подсчета клеток и анализ с помощью проточной цитометрии показано на рисунке 2C. Процент βIII-тубулина + клеток был determINED путем подсчета общего числа клеток (за счет ядерное окрашивание DAPI) и число βIII-тубулина + клеток в флуоресценции картины.
Рисунок 1. hNPCs культивировали в самоорганизации PuraMatrix гидрогеля пептида.) hNPCs инкапсулированных в PuraMatrix (PM) растут в сферических, плотные упакованных структур, где диаметр сфер может быть до нескольких сотен мкм. В перерывах между сферами можно узнать пучки процессов застроена клетки (стрелки). Б) Клетки инкапсулированные в PuraMatrix дополнен ламинин (ПМЛ) растут в менее плотных структур, более однородно распределены. В ламинин дополнить матрицу можно признать одной клетки в менее плотных областей (стрелки), однако вряд ли можно дать количественную оценку числа клеток. C) hNPCs дифференцированных течение 4 дней в ПМЛ выражают нейронный маркер как βIII-тубулина (зеленый). Для оценТе процент позитивных клеток нужно определить общее число ячейки ядер окрашивания как DAPI (синий). Микрофотография представлена полная проекция Z-Stack от фотографий, сделанных с Biozero-8000 микроскопом. D) Клетки освобождаются от матрицы может быть заполнена, например, на промахи прикрытие для дальнейших функциональных исследованиях. Микрофотография показывает клетки культивировали в течение 3-й, затем на освобождение процедуры. Окрашивание на βIII-тубулина (красный) показывает, сопоставимой морфологии клетки, размещенных в 3D эшафот.
Рисунок 2. Поток клетки цитометрии анализа освобожден из PuraMatrix. Чтобы преодолеть много времени количественное микрофотографии мы использовали протокол, чтобы освободить клетки культивировали в PuraMatrix, дающие доступ к быстрый анализ с помощью проточной цитометрии. А) Необработанный клетки были использованы в качестве отрицательного контроля, чтобы установить ворота (черная рамка) для анализа в дальнейшем, например, βIII-тубулина клеток. В) Для количественной оценки процент βIII-тубулина + клеток тех же ворот, установленных в отрицательный контроль, был использован. Положительные клетки появляются в правой части оси Х, где также промежуточные населения наблюдалась (пунктирная рамка), скорее всего, представляющие ячейку мусора. C) Сравнение ручного рассчитывал клетки и клетки рассчитывали с помощью проточной цитометрии показал гораздо более высокую долю положительных клеток, где временная зависимость числа βIII-тубулина + был сопоставим, что свидетельствует о надежности протокола проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование 3D-строительные леса предлагает возможность изучать развитие различных типов клеток в культуре клеток ситуация ближе к ситуации в естественных условиях. Однако, что касается анализа, например, нейронных дифференциации или функциональные исследования нужно преодолеть некоторые препятствия, чтобы получить достоверные данные, например, для количественной оценки типов клеток.
Здесь мы описали культуру hNPCs в пептид гидрогеля основан эшафот PuraMatrix и в дальнейшем выпуск ячеек, которые будут использоваться для исследований в 2D ситуации обеспечивает простой доступ к инструментам, как FACS или функционального анализа. Недавно мы показали влияние PuraMatrix концентрации на формирование 3D-эшафот с помощью атомно-силовой микроскопии и влияние на выживание и дифференциации клеток. 13 Тем не менее, надо иметь в виду, что каждый тип клеток, возможно, потребуется другая культура условий или матрицы, состоящие из других материалов, например, matrigэль или коллагена.
Протокол к выпуску клетки основан на протоколе, предоставляемых производителем 18 и сравнима с протоколами, используемыми для подготовки, например, первичные нейронов культурах, где механической изоляции клеток следуют переваривания окружающего материала ферментами. Клетки переносят эту процедуру и оставаться жизненно важным и создал процессов и выразить нейронный маркер как βIII-тубулина, как только они будут посеяны снова ламинин покрытием. Здесь мы провели исследования проточной цитометрии с выпускаемой клетки количественно количество βIII-тубулина + клеток. По сравнению с количественной сделать "вручную" путем подсчета клеток в микрофотографии выявили гораздо более высокая доля βIII-тубулина + клеток. Скорее всего, это связано с большим числом клеток подсчитываются Проточный цитометр (50.000 в зонда) по сравнению с ручной анализ (несколько сотен в зонд). Тем не менее, кинетика число и бETA, III-тубулина + клеток по той же схеме в обоих образцах, где мы обнаруживаем снижение βIII-тубулина + клеток с течением времени. Это в соответствии с исследований с использованием ReNcell В. М. клеток. 15-17 Другие препятствия преодолеть во время ручного анализа очень плотные области матрицы, которые вряд ли могут быть проанализирована или высоком фоне материала матрицы приводит к недооценке "реальной" номер ячейки. Мы убеждены, что этот протокол может быть адаптирован для других типов клеток, обеспечивая быстрый и надежный способ количественно некоторые аспекты пролиферации, дифференцировки и выживания клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Нормана Крюгер за его отличную техническую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Biosciences | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Carl Roth Gmbh | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck & Co., Inc. | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck & Co., Inc. | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
References
- Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).
- Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine. Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).
- Blow, N. Cell Culture: building a better matrix. Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).
- Hauser, C. A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials. Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).
- Teng, Y. D. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).
- Silva, G. A. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science. 303, 1352-1355 (2004).
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).
- Taraballi, F. Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures. Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).
- Zhang, S. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).
- Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration. PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).
- Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro. Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).
- Ortinau, S. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).
- Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T.
- Morgan, P. J. Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine. Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).
- Giese, A. K. Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells. BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).
- Schmöle, A. C. Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells. Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).
- PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. Guidelines for Use. Catalog No 354250, BD. (2006).
