زراعة خلايا العصبية السلف في هيدروجيل 3 الابعاد الذاتي تجميع الببتيد
Summary
نحن هنا وصف استخدام ذاتي تجميع 3 الابعاد سقالة للثقافة الإنسان الخلايا العصبية السلف. نقدم بروتوكولا للافراج عن الخلايا من السقالات التي سيتم تحليلها في وقت لاحق من قبل مثل التدفق الخلوي. قد يكون هذا البروتوكول لتكييف أنواع الخلايا الأخرى لتنفيذ دراسات مفصلة ميكانيكيا.
Abstract
تأثير السقالات (3D) 3 الأبعاد على تمايز نمو وانتشار الخلايا العصبية وأخيرا هي ذات أهمية كبيرة من أجل العثور على طرق جديدة لعلاج الخلايا وموحدة تستند في اضطرابات عصبية أو أمراض الاعصاب. ومن المتوقع أن هياكل 3D لتوفير بيئة أقرب الى الوضع في الجسم الحي من الثقافات 2D. في سياق الطب التجديدي ، ومزيج من مادة بيولوجية مع السقالات والخلايا الجذعية العصبية السلف يحمل وعدا كبيرا كأداة علاجية. أثبتت أنظمة الثقافة 1-5 محاكاة بيئة ثلاثية الأبعاد للتأثير على انتشار والتفريق في أنواع مختلفة من الساق و السلف الخلايا. هنا ، في تشكيل وfunctionalisation من microenviroment – 3D المهم تحديد بقاء ومصير الخلايا المدمجة. 6-8 تستخدم نحن هنا PuraMatrix 9،10 (RADA16 ، م) ، وهو يستند الببتيد سقالة هيدروجيل ،الذي يوصف بشكل جيد وتستخدم لدراسة تأثير بيئة – 3D على أنواع مختلفة من الخلايا يمكن. 7،11-14 PuraMatrix تكون مخصصة بسهولة وتلفيق الاصطناعية من ألياف النانو يوفر نظام الثقافة 3D – الموثوقية العالية ، والتي بالإضافة xeno خالية.
مؤخرا درسنا تأثير تركيز – PM على تشكيل سقالة 13 في هذه الدراسة استخدام تركيزات رئيس مجلس الوزراء كان لها تأثير مباشر على تشكيل هيكل – 3D ، والذي تجلى من خلال مجهر القوة الذرية. وكشف تحليل لاحقة للبقاء على قيد الحياة والتمايز من hNPCs تأثير تركيزات من استخدام رئيس مجلس الوزراء حول مصير الخلايا المدمجة. ومع ذلك ، فإن تحليل بقاء أو تمايز الخلايا العصبية عن طريق تمتلك تقنيات المناعي بعض العقبات. للحصول على بيانات موثوق بها ، وعلى المرء أن تحديد العدد الإجمالي للخلايا داخل مصفوفة للحصول على العدد النسبي للمثل. الخلايا العصبية التي تميزت βIII – تويولين. هذا متطلبات تقنية لتحليل السقالات في جميع الأبعاد 3 – بواسطة المجهر مبائر أو تقنية مشابهة مثل المجاهر مضان قادرا على اتخاذ Z – أكوام من العينة. وعلاوة على هذا النوع من التحليل هو قتا طويلا جدا.
نحن هنا شرح طريقة للافراج عن الخلايا من السقالات 3D – لتحليلها لاحقا من قبل مثل التدفق الخلوي. في هذا البروتوكول ومثقف خلايا العصبية السلف (hNPCs) من الخلية ReNcell خط VM (ميليبور الولايات المتحدة) ومتمايزة في 3D – السقالات التي تتكون من PuraMatrix (بعد الظهر) ، أو تستكمل مع PuraMatrix laminin (PML). في أيدينا كانت PM – تركيز 0.25 ٪ المثلى لزراعة الخلايا 13 ، لكن يمكن تطويعها للتركيز على أنواع الخلايا الأخرى (12). ويمكن استخدام الخلايا الافراج عن immunocytochemical الدراسات على سبيل المثال وتحليلها في وقت لاحق من قبل التدفق الخلوي. يسرع هذا التحليل وموإعادة أكثر ، وبقية البيانات التي تم الحصول عليها بناء على قاعدة أوسع ، وتحسين موثوقية البيانات.
Protocol
Discussion
استخدام 3D – السقالات يتيح الفرصة لدراسة تطوير أنواع مختلفة من الخلايا في خلية ثقافة الوضع أقرب إلى الوضع في الجسم الحي. ومع ذلك ، بخصوص تحليل تمايز الخلايا العصبية مثلا أو الدراسات الفنية للمرء أن التغلب على بعض العقبات التي تحول دون الحصول على بيانات موثوق بها ل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر نورمان كروجر لدعمه فنية ممتازة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Bioscience | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Roth | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | Gibco | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
References
- Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).
- Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine. Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).
- Blow, N. Cell Culture: building a better matrix. Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).
- Hauser, C. A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials. Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).
- Teng, Y. D. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).
- Silva, G. A. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science. 303, 1352-1355 (2004).
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).
- Taraballi, F. Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures. Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).
- Zhang, S. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).
- Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration. PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).
- Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro. Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).
- Ortinau, S. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).
- Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).
- Morgan, P. J. Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine. Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).
- Giese, A. K. Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells. BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).
- Schmöle, A. C. Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells. Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).
- PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).
