Summary
כאן אנו מתארים את השימוש של הרכבה עצמית 3 ממדי הפיגום לתרבות תאים אנושיים אבי עצביים. אנו מציגים פרוטוקול לשחרר את התאים מן הפיגומים כדי להיות מנותח למשל לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה. פרוטוקול זה עשוי להתאים סוגי תאים אחרים לבצע מחקרים מפורטים באופן מכניסטי.
Abstract
ההשפעה של 3 ממדי (3D) פיגומים על בידול, צמיחה שגשוג עצבי ולבסוף הוא עניין רב כדי למצוא שיטות חדשות עבור טיפולים מבוססי תאים סטנדרטיים ב הפרעות נוירולוגיות או מחלות ניווניות. 3D מבנים צפויים לספק סביבה הרבה יותר קרוב במצב vivo מאשר תרבויות 2D. בהקשר של רפואה רגנרטיבית, השילוב של פיגומים ביולוגי עם גזע עצביים ועל ובתאים טומן בחובו הבטחה גדולה ככלי טיפולי. 1-5 במערכות התרבות חיקוי סביבת תלת מימדי הוכחו להשפיע על התרבות והתמיינות בסוגים שונים של גזע ובתאים. בזאת, היווצרות של functionalisation microenviroment-3D חשוב כדי לקבוע את הישרדות גורלם של תאים מוטבע. 6-8 כאן השתמשנו PuraMatrix 9,10 (RADA16, AM), הידרוג פפטיד פיגום מבוסס,אשר מתואר היטב בשימוש ללמוד את השפעת הסביבה-3D על תאים מסוגים שונים. 7,11-14 PuraMatrix יכול להיות מותאם אישית בקלות את ייצור סינתטי של סיבים ננו מספק מערכת 3D-התרבות של אמינות גבוהה, אשר בנוסף קסנו חינם.
לאחרונה יש לנו חקר את ההשפעה של ריכוז PM על היווצרות של הפיגום. 13 במחקר זה נעשה שימוש בריכוזים של ראש הממשלה הייתה השפעה ישירה על היווצרות של מבנה-3D, אשר הודגם על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. ניתוח בדיעבד של הישרדות והבחנה של hNPCs גילה השפעה של הריכוזים של שימוש PM על גורלם של תאים מוטבע. עם זאת, ניתוח של הישרדות או בידול העצבית באמצעות טכניקות posses immunofluorescence כמה משוכות. כדי לקבל נתונים אמינים, יש לקבוע את המספר הכולל של תאים בתוך מטריצה להשיג את המספר היחסי של למשל. תאים עצביים בסימן טובולין-βIII. זה תנאים מוקדמים טכניקה לנתח את הפיגומים בכל 3 מימדים על ידי מיקרוסקופ confocal או טכניקה דומה כמו מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסוגל לקחת Z-ערימות של הדגימה. יתר על כן סוג זה של ניתוח היא מאוד זמן רב.
כאן אנו להדגים שיטה לשחרר את התאים מן 3D-פיגומים למשל את הניתוח מאוחר יותר על ידי cytometry הזרימה. בפרוטוקול זה אנושי ובתאים עצביים (hNPCs) של הקו הסלולרי ReNcell VM (Millipore ארה"ב) היו תרבותי מובחן ב-3D פיגומים המורכב PuraMatrix (PM) או PuraMatrix בתוספת laminin (PML). בידיים שלנו PM-ריכוז של 0.25% היה אופטימלי לגידול של 13 תאים, לעומת זאת ריכוז יכול להיות מותאם סוגי תאים אחרים. 12 התאים שפורסמו ניתן להשתמש ללימודי immunocytochemical למשל ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה. הדבר מאיץ את הניתוח מושוב ושוב, את שאר הנתונים המתקבלים על בסיס רחב יותר, לשפר את אמינות הנתונים.
Protocol
1. חלק 1: תרבות hNPCs ב PuraMatrix
- לקראת לדור של פיגום עם ריכוז PuraMatrix של 0.25% ללא laminin אחד צריך להכין את הפתרונות הבאים
- הכן תמיסה המכילה 20% סוכרוז ו תמיסה המכילה 10% סוכרוז מומס במים מזוקקים סטריליים.
- עבור 1 120 μl פתרון שילוב של הפתרון סוכרוז 20% עם 120 μl של מים מזוקקים בתוך שפופרת מ"ל 1.5 חרוטי.
- במשך 2 μl 60 פתרון שילוב של הפתרון PuraMatrix עם 60 μl של פתרון סוכרוז 20% צינור חרוטי 1.5 מ"ל.
הכנה של פיגום עם ריכוז PuraMatrix של 0.25% בתוספת laminin (8 מיקרוגרם לכל מטריקס 100 μl) אחד צריך להכין את הפתרונות הבאים.
- עבור μl פתרון 1 לערבב 72 של מים מזוקקים עם 120 μl של פתרון סוכרוז 20% ו 48 laminin μl בצינור מ"ל 1.5 חרוטי.
- במשך 2 פתרון לערבב פתרון PuraMatrix 60 μl עם 60 μl של הפתרון סוכרוז 20% צינור חרוטי 1.5 מ"ל.
- עבור embedment של תאים PuraMatrix להכין 4-היטב בתרבות צלחת התא במקום זכוכית מעוקר לכסות להחליק (13 מ"מ קוטר) בשתי בארות. אחסן את הצלחת הספסל נקי לשימוש מאוחר יותר. תלושי זכוכית לכסות משמשים רק עבור מחקרים immunocytochemical. אם לא stainings immunocytochemical מיועדים, בשלב יכול להיות פסח.
כדי להכין את hNPCs אנקפסולציה באחד פיגומים 3D יש להכין את הפתרונות הבאים. לדלל את Benzonase בפתרון טריפסין / EDTA, באמצעות גורם לדילול של 1:10.000. לקבלת תערובת פתרון Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + מעכבי טריפסין (0.5mg/ml).
- ניתוק התאים על ידי הוספת 500 μl פתרון טריפסין / Benzonase ו דגירה של 5 דקות באינקובטור (37 ° C-CO, 5% 2). עצור את התגובה פתרון Trypsin-Inhibitor/Benzonase. בהמשך צנטריפוגות התאים מנותקת במשך 5 דקות ב 3000 x ז שטפו תאים עם פתרון 5 מ"ל סוכרוז 10% צנטריפוגות שוב. בטל supernatant.
- Resuspend התאים פתרון סוכרוז 10%, הפתרון הסופי אמור להכיל תא 1x10 6 תאים / מ"ל.
הצעדים הבאים, 1.8-1.11, צריך להיעשות מהר ככל האפשר, בגלל ה-pH הנמוך של התמיסה PuraMatrix, אשר עלול להזיק לתאים.
- מערבבים 60 μl של השעיה תא עם פתרון 1.
- הוסף 120 μl של פתרון 1, המכיל את התאים, אל צינור חרוטי עם פתרון 2 ומערבבים היטב.
- מקום 100 μl של התערובת מיד לכסות כל תלושי התגורר צלחת 4-הבאר.
- מוסיפים לאט בינוני 200 μl תרבית תאים לכל היטב לאחר 2-3 דקות אחר μl 200. זה יהיה ליזום את הרכבה עצמית של מטריקס.
- דגירה גאמות על 37 מעלות צלזיוס, במשך 1h ב הספסל נקי על צלחת חימום או אזור חם של ספסל נקי שלך. במידת האפשר שלא להזיז את הצלחת כמו זה עלול לפגוע והרכבה של מטריצות.
- הסר ביותר של המדיום, אבל לא הכל, כדי להימנע מטריצות נופלים יבש, עם פיפטה 1000 μl. הוסף 500 μl של המדיום כדי לשטוף מטריצות עבור 10 דקות. לבסוף להסיר את המדיום ולהוסיף 500 בינוני טרי μl והמקום צלחת תרבות באינקובטור (37 ° C-CO, 5% 2). כמו מטריצות רגישים ההלם צלחות צריך להתרגש כמו פחות ככל האפשר מאוחסן, במידת האפשר, בתוך חממה נפרד.
- HNPCs השתמשו כאן היו התרבו במשך 7 ימים ב-3D פיגומים והבחנה ביוזמת הנסיגה של גורמי גדילה 13. בינוני שונתה כל 2-3 ימים.
2. חלק 2: מכתים Immunocytochemical של מטריצות כולו
- לקראת הליך מכתים אחד צריך להכין: abחיץ פתרון נעילה המורכב בסרום 5% עז נורמלי 0.3% טריטון X-100 (מומס PBS, פתרון paraformaldehyde 4% על בסיס 0.1 מ PBS ואם יש צורך בפתרון עם 4 ',6-Diamidin-2 ", phenylindoldihydrochlorid DAPI) עבור מכתים גרעינים המכיל 100 ng DAPI / מ"ל מומס PBS. דוגמאות היו רכוב בתערובת של Mowiol ו DABCO.
- כדי לשטוף מטריצות להסיר את המדיום עם פיפטה 1000 μl ולשטוף הפיגומים עם PBS פעם אחת במשך 5 דקות.
- כדי לתקן את הפיגומים להסיר את PBS ולהוסיף 400 μl של paraformaldehyde (4% ב 0.1 M PBS) היטב כל דגירה מטריצות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. פיגומים קבועים ניתן לאחסן PBS בתוספת 0.02% NaN 3 על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות עד מספר חודשים.
- לקראת מכתים לשטוף את הפיגומים עם PBS במשך 5 דקות.
- דגירה פיגומים בחסימת פתרון חיץ. פתרון חסימת שונתה שלוש פעמים כל 2-3 שעות subsequently פיגומים הודגרו בפתרון חסימת מעל בלילה 4 ° C.
- הסר את הפתרון למאגר חסימת ומוסיפים את הנוגדן העיקרי מומס PBS בתוספת סרום 1% עזים נורמלי דגירה מטריצות מעל בלילה 4 ° C.
- הסר את הפתרון נוגדן ראשוני לשטוף פיגומים 4 פעמים למשך 2 שעות, ולאחר מכן במשך הלילה בבית 4 ° C עם PBS.
- הסר את PBS ולהוסיף את הפתרון עם נוגדן המשני, מומס PBS בתוספת סרום 1% עזים רגילות, עבור 4 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
- שטפו את דגימות עם PBS 4-6 פעמים 1 שעות, ולאחר מכן במשך הלילה בבית 4 ° C בחושך.
- עבור מכתים גרעינים אפשר להוסיף 400 μl של הפתרון DAPI למשך 30 דקות.
- להר דגימות אחד צריך שקופיות מיקרוסקופ. הוסף 50 μl Mowiol / Dabco על שקופיות מיקרוסקופ. הסר את מכסה מחליק מהצלחת 4-הבאר ולשים אותם בזהירות על המדיום גובר.
- כאן השתמשנו 8000 Biozeroמיקרוסקופ (Keyence, גרמניה, קרלסרוהה) להשיג micrographs יחיד Z-ערימות. מחסנית מכילה 30 תמונות בודדות עם מרחק של 1-2 מיקרומטר. שימוש בתוכנה הנתח המתאים לטשטש את הטבועות הקרינה הוסר לפני התחזיות מלא של Z-ערימות יוצרו.
3. חלק 3: שחרור hNPCs מן פיגומים לצורך ניתוח זרימת cytometry
- מראש על מנת לשחרר את התאים מן הפיגומים לשטוף את הפיגומים עם 500 HBSS μl.
- העברת פיגומים באמצעות פיפטה 1000 μl אל צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל תרבות בינוני התא.
- כדי לשבש את הפיגומים מכנית resuspend הפתרון תא מספר פעמים עם פיפטה 1000 μl ובהמשך צנטריפוגות הפתרון XG ב 3000 עבור 5 דקות.
- הסר את supernatant עם טפטפת, להוסיף 500 μl של פתרון טריפסין / Benzonase ו resuspend פעמים התא גלולה מספר.
- דגירה התאים 5 דקותבשעה 37 ° C בתמיסה טריפסין / Benzonase. כדי להפסיק את תגובת להוסיף 1 Trypsin-inhibitor/Benzonase פתרון מ"ל פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים.
- צנטריפוגה ההשעיה תא 5 דקות XG ב 3000, להסיר את supernatant לשטוף את התאים עם חיץ מ"ל 2 HBSS. חזור על פעולה זו פעמיים. הליך זה יהיה להסיר שאריות מטריקס.
- לעבור את ההשעיה תא פתרון שוקת מסננת תא (גודל הנקבוביות 70 מיקרומטר) כדי להסיר אגרגטים לאסוף את התאים במדיום תרבית תאים. התאים המתקבלים ניתן seeded למשל שוב על תלושי לכסות ללימודי פונקציונלי כמו מהדק תיקון או מדידות fluometric. כדי לעבד את התאים עבור cytometry זרימה, לתקן את התאים באופן מיידי (ראה 4.1).
4. חלק 4: כימות βIII-טובולין תאים חיובית על ידי זרימת cytometry
- תיקון התאים שוחרר שהושגו בשלב 3.7 עם PFA 1% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה ההשעיה תא דקות 5 ב 3000 XG ו removהדואר supernatant. אם יש צורך, התאים יכולים להיות מוכנים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח מאוחר יותר. לכן התאים resuspend במאגר לשטוף (PBS בתוספת BSA 0.5% ו 0.02% Na-אזיד).
- כדי להמשיך עם ההכנות cytometry הזרימה, צנטריפוגה ההשעיה תא 10 דקות ב 350 XG, להשליך את supernatant ו resuspend התאים μl 25 הפתרון נוגדן. לכן הנוגדן הראשון הוא מעורב עם חיץ saponin בריכוז 1:100 למשל βIII-טובולין. חיץ saponin מורכב PBS עם ריכוז saponin של 0.5%, ריכוז BSA של 0.5% ואת ריכוז Na-אזיד של 0.02%.
- לדגור על השעיית התא עם הנוגדן הראשון h 2 בטמפרטורת החדר על שייקר. כביקורת שלילית להכין מדגם ללא הנוגדן הראשון.
- עבור השלב כביסה ראשית הוסף 300 μl חיץ saponin ישירות אל התאים. צנטריפוגה ההשעיה תא דקות 5 ב 350 x ז עבור שלב הכביסה השנייה, לבטל אתsupernatant, הוסף 300 μl ו חיץ צנטריפוגות ההשעיה תא דקות 5 ב 350 x ז
- הסר את supernatant ולהוסיף 25 μl פתרון המכיל את הנוגדנים משניים (למשל אלקסה פלואוריד 647, 1:1000, מומס חיץ saponin). דגירה תאים עם 1h את הנוגדן משני בטמפרטורת החדר, בחושך.
- עבור השלב כביסה ראשית הוסף 300 μl חיץ saponin ישירות אל התאים. צנטריפוגה ההשעיה תא דקות 5 ב 350 x ז עבור שלב הכביסה השנייה, לבטל את supernatant, להוסיף 300 חיץ μl ו צנטריפוגות ההשעיה תא דקות 5 ב 350 x ז
- בטל supernatant ו resuspend התאים חיץ 500 μl לשטוף לניתוח cytometry הזרימה.
5. נציג תוצאות
דוגמה hNPCs תרבותי של הרכבה עצמית הידרוג פיגום PuraMatrix מוצג באיור 1. HNPCs לגדול מבנים כמו spheric ב PM ללא שינוי. במצב זה תרבותים, תאים בקושי יכול להיות מוכר באור השידור, למרות צרורות של תהליכים בין הספירות גלויים (תאנה 1A). בהתאם לתנאי התרבות של סוג תא בשימוש, המטריצה ניתן לשנות למשל על ידי הוספת laminin. עבור קו התא hNPC ReNcell VM (Millipore) laminin יש צורך להשרות דפוס צמיחה עם אגרגטים פחות צפוף אבל חלוקה הומוגנית יותר של התאים (1B תאנה). העצמאית של שינויים, המטריצה ניתן ללמוד גזירה עצבי למשל. איור 1C מציג מכתים את hNPCs עבור הסמן העצבית βIII-טובולין. בדוגמה זו התאים גדלו במשך 7 ימים במטריצה הבדיל לאחר מכן במשך 4 ימים, שם היה בידול המושרה על ידי נסיגה של EGF הצמיחה גורמים bFGF. 13 גופים תא רשת צפופה של תהליכים נבנה על ידי תאים ניתן מוכר בקלות. עם זאת, ברור כי כימות של מספר התא זמן רב, כמו מספר רב שלתמונות של אזורים שונים של המטריצה יש לנתח, על מנת לקבל בסיס נתונים אמין לניתוח סטטיסטי. ב 1D תאנה אפשר לראות דוגמה של תאים שוחרר מבית מטריקס ו קלוע ובהמשך מחליק המכסה. תאים אלה עשויים לשמש מחקרים תפקודית.
שחרורו של התאים מן 3D-פיגומים מציעה את האפשרות לנתח פרמטרים שונים כמו ביטוי של חלבונים סמן או שיעור ההישרדות של התאים על ידי מכתים AnnexinV / PI או assay TUNEL. תרשים 2 מציג דוגמה של ניתוח תזרים cytometry של אחוז βIII-טובולין + תאים. בקרה שלילית (תאים שאינם מסומנים על טובולין, βIII) מוצגת דמות 2A. בקרות אלה משמשים כדי לקבוע את השער לגילוי מאוחר של βIII-טובולין + תאים (תאנה 2B). השוואה של ספירה ידנית של תאים על ידי ניתוח זרימת cytometry מוצגת דמות 2C. אחוז βIII-טובולין תאים + היה determעומד לבחינה על ידי ספירת מספר התאים הכולל (באמצעות מכתים DAPI גרעינית) ומספר βIII-טובולין תאים + בתמונות פלואורסצנטי.
באיור 1. hNPCs בתרבית PuraMatrix הרכבה עצמית הידרוג פפטיד.) hNPCs הגלום PuraMatrix (PM) לגדול, מבנים spheric צפופה, שם הקוטר של הכדורים יכול להיות עד עד מאות מיקרומטר מספר. בין הספירות אפשר לזהות צרורות של תהליכים נבנה על ידי התאים (חיצים). ב) תאים הגלום PuraMatrix בתוספת laminin (PML) לגדול מבנים פחות צפוף, להפיץ יותר homogenously. ב laminin בתוספת מטריצה ניתן לזהות תאים בודדים באזורים פחות צפופים (חיצים), אולם זה אפשרי בקושי לכמת את מספר התאים. ג) hNPCs הבדיל במשך 4 ימים בסמן להביע PML עצביים כמו טובולין-βIII (ירוק). כדי evaluate אחוז התאים החיוביים יש לקבוע את מספר הסלולרי סך ידי מכתים גרעינים כמו DAPI (כחול). Microphotograph מציג את התחזית המלאה של מחסנית-z של תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ Biozero-8000. ד) תאים שוחרר מבית מטריקס ניתן seeded על תלושי לכסות למשל ללימודי תפקודית נוספת. Microphotograph מראה תאים בתרבית עבור 3d, בהמשך להליך שחרור. מכתים עבור טובולין-βIII (אדום) מגלה מורפולוגיה דומה בתאי מתארח הפיגום 3D.
באיור 2. Cytometry זרימת התאים ניתוח שוחרר מבית PuraMatrix. כדי להתגבר על כימות זמן רב של microphotographs השתמשנו פרוטוקול לשחרר בתאים בתרבית PuraMatrix מתן גישה לניתוח מהיר של cytometry הזרימה. ) תאים בלא כתם שימשו בקרה שלילית, להגדיר את השער (מסגרת שחורה) לצורך ניתוח מאוחר יותרלמשל של βIII-טובולין תאים. ב) כדי לכמת את אחוז טובולין-βIII + התאים את השער אותו, להגדיר שליטה שלילית, היה בשימוש. תאים חיובי להופיע בחלק הימני של ציר X, שם גם אוכלוסייה ביניים נצפתה (מסגרת מקווקו), קרוב לוודאי פסולת התא המייצג. ג) השוואה של תאים נספר ותאי ידני נספר על ידי זרימת cytometry גילה שיעור גבוה בהרבה של תאים חיובי, שבו תלות זמן של מספר טובולין-βIII + היה דומה, המציין את האמינות של פרוטוקול cytometry הזרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש ב-3D פיגומים מציעה את ההזדמנות ללמוד על התפתחות תאים מסוגים שונים במצב תרבית תאים קרובים יותר במצב vivo. עם זאת, לגבי ניתוח של התמיינות נוירונים למשל או מחקרים פונקציונלי יש צורך להתגבר על כמה מכשולים כדי לקבל נתונים מהימנים על כימות למשל של סוגי תאים.
כאן אנחנו יכולים לתאר את התרבות של hNPCs ב הידרוג הפפטיד מבוסס פיגום PuraMatrix ושחרור לאחר מכן התאים לשמש המחקרים במצב 2D מתן גישה נוחה לכלים כמו FACS או מבחני תפקודית. לאחרונה הראינו את ההשפעה של ריכוז PuraMatrix על היווצרות של 3D-הפיגום באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי לבין השפעה על ההישרדות ועל הבידול של התאים. 13 עם זאת, יש לזכור כי כל סוג תאים עשויים להזדקק תרבות אחרת תנאים או מטריצות המורכב של חומרים אחרים כגון matrigאל או קולגן.
הפרוטוקול כדי לשחרר את התאים מבוססת על פרוטוקול שסיפק היצרן 18 והוא דומה עם פרוטוקולים המשמשים להכנת למשל תרבויות העצבית העיקרי שבו בידוד מכני של התאים מלווה העיכול של החומר המקיף על ידי אנזימים. התאים לסבול הליך זה ולהישאר חיוני בנוי תהליכים להביע סמן עצביים כמו טובולין-βIII, פעם הם זורעים שוב על משטח מצופה laminin. כאן ביצענו מחקרים cytometry לזרום עם תאים שוחרר לכמת את כמות βIII-טובולין + תאים. ההשוואה כימות שנעשה "ידנית" על ידי ספירת התאים micrographs גילה שיעור גבוה יותר של βIII-טובולין + תאים. זהו ככל הנראה עקב מספר גבוה של תאים נספר על ידי cytometer הזרימה (50.000 לכל בדיקה) בהשוואה לניתוח ידני (כמה מאות לכל בדיקה). עם זאת, קינטיקה של מספר & bהאטה; III-טובולין + תאים כדלקמן אותו דפוס בדגימות שני, איפה אנחנו מזהים ירידה של βIII-טובולין + התאים לאורך זמן. זה בהתאם מחקרים באמצעות VM תאים ReNcell. 15-17 משוכות אחרות כדי להתגבר במהלך ניתוח ידני הם אזורים צפופים מאוד של מטריצות אשר בקושי יכול להיות מנותח או רקע גבוהה של החומר מטריקס וכתוצאה מכך הערכה נמוכה מדי של "אמיתי" תא מספר. אנו משוכנעים כי בפרוטוקול זה ניתן להתאים סוגי תאים אחרים מספקים שיטה מהירה ואמינה לכמת כמה היבטים של בידול שגשוג, או ההישרדות של התאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות נורמן קרוגר עבור התמיכה הטכנית המצוינת שלו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Biosciences | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Carl Roth Gmbh | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck & Co., Inc. | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck & Co., Inc. | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
References
- Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).
- Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine. Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).
- Blow, N. Cell Culture: building a better matrix. Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).
- Hauser, C. A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials. Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).
- Teng, Y. D. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).
- Silva, G. A. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science. 303, 1352-1355 (2004).
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).
- Taraballi, F. Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures. Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).
- Zhang, S. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).
- Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration. PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).
- Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro. Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).
- Ortinau, S. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).
- Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).
- Morgan, P. J. Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine. Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).
- Giese, A. K. Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells. BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).
- Schmöle, A. C. Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells. Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).
- PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. Guidelines for Use. Catalog No 354250, BD. (2006).
