Summary
נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.
Abstract
בעלי חיים לטעום הסביבה הריחנית סביבם דרך מערכות chemosensory ממוקמות בחלל האף. אותות Chemosensory להשפיע התנהגויות מורכבות כגון בחירת אוכל, טורף, conspecific והכרת בן זוג ורמזים חברתיים רלוונטיים אחרים. נוירונים קולטניים ריח (ORNs) ממוקמים בחלק הגבה של חלל האף המוטבע באפיתל ההרחה. הנוירונים דו קוטביים אלו שולחים אקסון לנורת חוש הריח (ראה איור. 1, Reisert & זאו 1, שפורסם במקור בכתב העת של פיזיולוגיה כללית) ולהרחיב דנדריט אחת לגבול אפיתל ממקום שבי להקרין ריסים לליחה המכסה את חוש הריח האפיתל. הריסים מכילים מנגנון העברת האותות שסופו של דבר מוביל לגירוי זרם זרם דרך ערוצי ריסי transduction, ערוץ מחזורי נוקלאוטיד-מגודר (CNG) וCa 2 +-Cl פעיל - ערוץ (1 איור). Depola התפתחrization מפעיל דור פוטנציאל פעולה בגוף התא 2-4.
בסרטון זה אנו מתארים את השימוש של "טכניקת יניקת פיפטה" לרשום תגובות odorant מושרים מORNs. שיטה זו פותחה במקור כדי להקליט מphotoreceptors המוט 5 וריאנט של שיטה זו ניתן למצוא בjove.com השונה כדי להקליט מphotoreceptors קונוס העכבר 6. טכניקת יניקת פיפטה מאוחר יותר הותאם גם להקליט מORNs 7,8. בקצרה, לאחר הניתוק של האפיתל ההרחה ובידוד תא, גוף התא כולו של orn נשאב לתוך קצה פיפטה הקלטה. דנדריט והריסים יישארו חשוף לפתרון אמבטיה ובכך נגיש לשינויי פתרון שיאפשר odorant למשל או יישום חוסם תרופתי. בתצורה זו, אין לו גישה לסביבה התאית היא צברה (לא מהדק מתח כל תאים) והמתח התאי נותר חופשי להשתנות. כל זהows ההקלטה סימולטני של זרם הקולט האיטי שמקורו בריסים ופוטנציאל פעולה מהיר שנורה על ידי גוף התא 9. ההבדל בקינטיקה בין שני אותות אלה מאפשר להם להיות מופרדים באמצעות גדרות מסננות שונות. טכניקה זו ניתן להשתמש בכל סוג פרא או עכבר נוקאאוט או להקליט באופן סלקטיבי מORNs שגם מבטא GFP לתייג תת ספציפי של ORNs, למשל מבטא קולט odorant נתון או ערוץ יון.
Protocol
1. הגדרת ההקלטה
חדר ההקלטה הוא רכוב על המיקרוסקופ ניקון TE2000U אקליפס הפוך עם אופטיקה לעומת השלב בו מצויד על שולחן אוויר וחשמל מוגן באמצעות כלוב פאראדיי. חדר הקלטת פרספקס מורכב משני חלקים מופרדים באופן חלקי על ידי מחסום והודבק על גבי זכוכית silanized. בחלקו האחד של החדר משמש ליישב את התאים ואילו השני משמש לגירוי חשיפה במהלך ההקלטה המוקדמת כדי למזער את החשיפה של התיישב אך עדיין אינם בשימוש תאים לodorant. הגדרת ההקלטה מורכבת מפיפטה שאיבה (ראה בהמשך) עלתה בבעל פיפטה pelleted והאלקטרודה קרקע. פיפטה היניקה תמוקם באמצעות micromanipulator. פתרוני תמריצים מיושמים באמצעות צינור מרובע זכוכית משולשת חבית, עם כל צינור מרובע להיות 0.7 מ"מ x 0.7 מ"מ. הזכוכית משולשת החבית הייתה קשורה למערכת ממונעת מהירה צעד זלוף רכוב על מניפולטור (Sutter SF-77B, וורנר מכשירים) ונכנסו לחדר ההקלטה בזווית של 45 מעלות ~. סוף כוס החבית המשולשת היה משופע בזווית של 45 מעלות שוב כאלה שהפנים הסופיים (פתיחה) של הזכוכית משולשת החבית היו אנכיים, כדי לאפשר מיקום קרוב של פיפטה.
האלקטרודה פיפטה יניקה מלאה פתרון סטנדרטי יונקי רינגר והאלקטרודה הקרקע מחוברת לheadstage 1 GΩ של מגבר מהדק תיקון (PC-501A, וורנר מכשירים) במצב מהדק מתח. האות האנלוגית מהמגבר (נמוך לעבור סינון בשעת 5 קילוהרץ) מוצגת באוסצילוסקופ דיגיטלי לנטר את האות בזמן אמת וגם מחוברת ל8-מוט Bessel מסנן (קרוהן-הייט) שבו האות נמוכה לעבור סינון בתדר 50 רץ. שני האותות (נמוך לעבור סינון בkHz 5 ו 50 הרץ) מוזנים לתוך / D ממיר (MKII קיימברידג' האלקטרונית עיצוב המייקר 1401) אשר מחובר למחשב נתונים לרכישה. הנתונים נרשם באמצעות האותות 3 ACQuisition תוכנה (עיצוב אלקטרוני קיימברידג') בתדר דגימה של 10 קילוהרץ. האות מוקלטת בשני התדרים השונים כדי להקליט את הקולטן הנוכחי יחד עם פוטנציאל פעולה על גבי זו ולאחר מכן הקולט הנוכחי בלבד (ראה איור. 2) 1. מערכת זלוף משמשת כדי לעבור במהירות בין פתרון רינגר (שליטה) וגירויי odorant או כל פתרון של קומפוזיציה רצויה והוא נשלט על ידי 3 תוכנת המחשב ואותות. הפתרונים כלולים ב60 מיליליטר מזרקים וקצב הזרימה נשלט על ידי וסת זרימת עירוי רפואי בדרגה. בדרך כלל, קצב הזרימה מוגדר 1 מ"ל / דקה.
השאיבה בפיפטה ההקלטה נשלטת באופן הבא: יציאת הצד של בעל פיפטה מחוברת לקו נפט אשר בתורו מחובר למאגר נפט הגובה מתכוונן. העלאה או הורדת המאגר מבטיחה שלחץ פיפטה ולכן זרימת רינגר דרך קצה עמ 'ipette הוא מינימאלי ומעט חיובי. שאיבה או לחץ נוספת יכולה להיות מיושמת באמצעות צינורית מחוברת למרחב האווירי של המאגר בשופר בקצה השני למצוץ גוף התא של orn מבודד בקצה פיפטה ההקלטה.
הניסויים מבוצעים על 37 מעלות צלזיוס, כדי לדמות את המצב הפיזיולוגי המולד של התא באופן הדוק. הטמפרטורה נשלטת על ידי עובר את הפתרונים דרך הסקת מחוייט אשר מורכבת מנגדים קרמיים שדרך צינורות נירוסטה המכילים את הפתרונים שהם עברו 10. הטמפרטורה היא פיקוח באמצעות מדחום תרמי (פלוק).
2. פתרונות
הפתרון של רינגר יונקים (מ"מ): 140 NaCl, KCl 5, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0.01 EDTA, 10 HEPES, 10 גלוקוז. PH הותאם ל 7.5 עם NaOH. 10% תמיסה מדוללת של רינגר שמשה למדידה לצומת נוכחית. Odoraפתרוני nt: Acetophenone וeugenol הוכנו יומי בתמיסה של רינגר 20 ממניות DMSO מ"מ.
3. ביצוע אלקטרודות
- הנח זכוכית ורוסיליקט unfilamented נימים בחולץ סאטר P-97 micropipette ולמשוך micropipette עם להתחדד ארוך.
- העברת פיפטה לבעל micropipette מחוייט רכוב על מיקרוסקופ Eclipse E200 ניקון אשר בתורו המצויד בreticle בעינית וסכין יהלום מטלטלין רכובים על הבמה.
- הקפד על קצה פיפטה תחת 20x האובייקטיבי ובאמצעות reticle כמדריך; עדינות הסופר פיפטה בזווית של 90 מעלות באמצעות סכין יהלום מחוייט בי פיפטה היא רחבה 10 מיקרומטר (קוטר חיצוני).
- העבר את סכין יהלום נוסף לקראת הקצה ובהדרגה תפעיל לחץ על הקצה עם סכין היהלום. קצה פיפטה צריך לשבור נקי בנקודה שבה היה לשייף.
לחלופין צעדים 3.1 ל3.4 ניתן לשלב וpipettes ניתן משך עם ממדים רצויים ישירות ללא צורך לחתוך את קצה פיפטה, למרות שזה יכול להוכיח קשה יותר למשוך אמין pipettes בקוטר כה גדול עצה וקצוות נחתכו באופן מדויק.
- תחת אובייקטיבי 40X, לפטר ללטש קצה פיפטה לקוטר פנימי של 5 מיקרומטר באמצעות חוט חשמלי מחומם. פעם סיים, micropipette מוכן לשמש להקלטה מזרמי ORNs עכבר. התנגדות פיפטה הפתוחה צריכה להיות סביב 1 MΩ כאשר התמלא רינגר.
4. בידוד של תאי עצב קולטני ריח
- להקריב עכבר בעקבות הנחיות ותקנות מוסדיות. הסר את ראשו, מקלף את העור שמעל הגולגולת ומדיאלית חוצה את הראש לאורך קו האמצע.
- הנח את 2 hemi-הראשים תחת stereomicroscope לנתח, לשלוף את מחיצת האף ולהסיר את turbinates הריח. מניח את כל הרקמות בצלחת פטרי עם ג גלוקוזontaining פתרון Ringer של יונקים.
- פיל אפיתל ההרחה את הסחוס הבסיסי משתי turbinates ולהעביר את הרקמה לתוך צינור המכיל אפנדורף רינגר μl 250. אנו משתמשים ברקמה מ2 turbinates כדי לקבל את הצפיפות הנכונה של תאים לגודל של חדר ההקלטה שלנו. אחסן את הרקמה שנותרה ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר.
- מערבולת צינור אפנדורף מכיל אפיתל ההרחה פעמים לזמן קצר ל1 שניות במהירות בינונית. צעד זה מוביל לניתוק מכאני של ORNs מהאפיתל.
- הנח את פתרון רינגר המכיל את ORNs ניתק בתא ההקלטה. הסר פיסות גדולות של רקמה גם בהווה בהשעיה באמצעות מלקחיים עדינים.
- תן ORNs להתפשר על 20 דקות לפני תחילת superfusion הרציף עם צלצול ולהמשיך להקלטות.
5. הקלטות
- מנמיך את האלקטרודה היניקה המחוברת לקו השמן לתוך תא ההקלטה וregulאכלתי את הגובה של מאגר הנפט להקים לחץ חיובי מעט בקצה פיפטה. ניתן לעשות זאת על ידי התבוננות פסולת תא למשל מתרחקת (לחץ חיובי) או לכיוון (לחץ שלילי) פיפטה. נסה שלא לזהם את קצה פיפטה בפסולת תא.
- סרוק את חדר ההקלטה לorn מבודד שיכול להיות מוכר על ידי המורפולוגיה דו הקוטבית הטיפוסית שלה באמצעות הגדלה של 20-40X. העבר את החוט הרושם לקרבה של גוף תא orn. מתחיל למצוץ בעדינות, כך שהגוף נכנס לתא קצה פיפטה. לאט ובזהירות ימשיך לחול יניקה עד שגוף התא כולו נשאב אל קצה פיפטה היניקה, עוזב דנדריט והריסים נחשפו לפתרון האמבטיה. לקבלת תמונות של ORNs ינק וצורות פיפטה לראות 7,11. ודא שברגע שאין יניקה מוחלת, orn לא זז פנימה או החוצה של פיפטה. אם כך, להתאים את הגובה של מאגר הנפט בהתאם.
- שימושmicromanipulators, להעביר את צינורית השאיבה מהמקטע המכיל את ORNs התיישב לסעיף ההקלטה של קאמרי. זהירות למקם את פיפטה היניקה מול הצינור 3-הקנים להחלפת פתרון. פיפטה היניקה צריכה להיות ממוקמת קרוב מספיק לפתיחת הצינור 3-הקנים כך שorn חשוף לזרימה למינרית וכך להימנע ממערבולת ערבוב ולהשיג תמורה מהירה פתרון. חילופי הפתרון מושגים על ידי דריכת הממשק בין זרמים מקבילים של פתרון זורם על פני קצה פיפטה היניקה. כמובן הזמן של חילופי הפתרון הוא בדרך כלל סביב 20 מילישניות, נמדדו מהצומת הנוכחית עורר על ידי דריכת התא בין פתרונות של הרכב יוני שונה (ראה איור. 2). פתרונות מועברים על ידי כוח הכביד.
6. נציג תוצאות
איור 1). A נוירונים קולטניים דו קוטבי בנורת חוש הריח. B) מכונות מעבר אותות בסופו של דבר מובילות לריסים מעוררי גל נוכחי. שלילת הקוטביות התפתחה מפעילה דור פוטנציאל פעולה בגוף התא.
תרשים 2 מציג את המהירות ואמינות של חילופי פתרון. פיפטה הוגברה מרגיל לצלצול דילול של 10% עבור 100 אלפית נוכחי הצומת כתוצאה מהריכוז יוני השונה נרשם. עקבות השחורות היא השדזעם של 5 ניסויים, אדום להתחקות SD שלה. השינוי הקטן בSD במהלך חילופי הפתרון מוכיח אמינות של חילופי פתרון ממשפט למשפט וחוסר הרעש עודף בזרם או פתרון.
איור 3 מציג תשובת eugenol מושרה מorn באמצעות טכניקת פיפטה יניקה. Orn נחשף לeugenol מיקרומטר 100 עבור 1 שני כפי שצוין על ידי הבר מעל ההקלטה. באיור. 3A (עקבות שחורות) הנוכחי הקולט היה מסונן ברוחב פס 0-50 הרץ כדי להציג את הקולטן הנוכחי רק איור.. 3B מציג את אותה קלטת, מסוננת עכשיו ברוחב הפס הרחב של 0-5000 רץ (אדום זכר) גם כדי להציג פוטנציאל פעולה (APS, מסומנת בחיצים). ההבלעה מציגה את אותו זכר בזמנים הרחיבו כדי להמחיש בצורה ברורה יותר נקודתי גישה בתחילת התגובה.
איור 4. משפחת מנת תגובה של orn eugenol-מגיב (). Eugenol שמש בריכוזים הנעים בין 0.3 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר, משך הגירוי היה 1 של עקבות וסוננו ב0-50 רץ. עלייה הדרגתית בריכוז odorant הובילה לתגובה גדולה יותר ומהירה יותר, שגם הסתיימה בקצב איטי יותר לאחר חשיפת odorant הופסקה.
ORNs יכול להציג דפוס תגובת oscillatory במהלך גירויים ארוכים בריכוזי odorant ביניים (איור 4 ב). הנה acetephenone (3 מיקרומטר) orn היענות היה מגורה במשך 8 שניות. לאחר שיא תגובה מהירה וחולפת בתחילת גירוי סדרה של תגובות קטנות יותר, חוזרות ונשנות הם נצפו. רוחב פס ההקלטה היה 0-50 רץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH DC009613, תכנית מדע הגבולות האנושית ומוראלית טיפול מלגה (לJR).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
