Summary

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Published: April 05, 2012
doi:

Summary

Neurônios receptores olfativos (ORNs) converter sinais de odor primeiro em um receptor de corrente que por sua vez desencadeia potenciais de ação que são transmitidos para os neurônios de segunda ordem no bulbo olfativo. Aqui, descrevemos a técnica da pipeta de sucção para gravar simultaneamente o receptor de odorante induzida atual e os potenciais de ação de ORNs mouse.

Abstract

Animais provar o ambiente à sua volta odorous através dos sistemas chemosensory localizados na cavidade nasal. Sinais chemosensory afetar comportamentos complexos como a escolha alimentar, predador, conspecific e reconhecimento mate e outras pistas socialmente relevantes. Neurônios receptores olfativos (ORNs) estão localizados na parte dorsal da cavidade nasal embutido no epitélio olfativo. Esses neurônios bipolares enviar um axônio para o bulbo olfatório (ver fig. 1, Reisert & Zhao 1, publicada originalmente no Jornal de Fisiologia Geral) e estender um único dendrito da fronteira epitelial de onde irradiam os cílios no muco que cobre o olfativo epitélio. Os cílios contêm o mecanismo de transdução de sinal que conduz finalmente à excitatórios influxo de corrente através dos canais de transdução ciliares, um nucleotídeo cíclico-gated canal (CNG) e um Ca 2 +-activated Cl canal (Fig. 1). O que se seguiu depolarization desencadeia geração do potencial de ação no corpo celular 2-4.

Neste vídeo, descrevemos o uso da "técnica da pipeta de aspiração" para gravar odorante respostas induzidas a partir de ORNs. Este método foi desenvolvido originalmente para gravar de bastonetes 5 e uma variante deste método pode ser encontrado em jove.com modificado para gravar a partir de fotorreceptores de rato cone 6. A técnica da pipeta de sucção foi mais tarde adaptado para gravar também a partir ORNs 7,8. Resumidamente, após a dissociação do epitélio olfactivo e isolamento de células, o corpo de célula inteira de um ORN é sugado para dentro da ponta de uma pipeta de gravação. O dendrite e dos cílios permanecer exposta à solução do banho e, portanto, acessível a solução muda para permitir, por exemplo odorante ou bloqueador aplicação farmacológica. Nesta configuração, não têm acesso ao ambiente intracelular é obtida (sem fixador de tensão de célula inteira) e a tensão intracelular é livre de variar. Isso tudouxos a gravação simultânea do atual receptor lento que se origina na cílios e potenciais de ação rápidos disparados pelo corpo celular 9. A diferença na cinética entre estes dois sinais permite que eles sejam separados utilizando diferentes configurações de filtro. Esta técnica pode ser utilizada em qualquer tipo selvagem ou de rato knockout ou para gravar selectivamente a partir de ORNs que também expressam GFP para rotular subconjuntos específicos de ORNs, por exemplo, expressando um receptor de odorante dado ou canal iónico.

Protocol

1. A configuração de gravação A câmara de gravação é montada num microscópio invertido Nikon Eclipse TE2000U com óptica de contraste de fase, que é montado em uma mesa de ar e electricamente blindado utilizando uma gaiola de Faraday. A câmara de Plexiglass gravação é composto por duas secções parcialmente separados por uma barreira e coladas sobre uma lâmina de vidro silanizado. Uma secção da câmara é usado para resolver as células, enquanto o outro é usado para o estí…

Discussion

<p class="jove_content"> A técnica da pipeta de aspiração é um método eletrofisiológico que é utilizado para registar o odor da corrente induzida do receptor lento e os potenciais de acção rápida a partir de um bifásicos ORN simultaneamente. Desde que a membrana plasmática da célula não seja ultrapassado, este método deixa o meio intracelular imperturbado assegurar que as respostas odorant não são alterados devido a alterações da concentração de iões no citoplasma ou de diluição de factores intracelulares. As células…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH DC009613, o Programa de Ciências Humanas Fronteiras e um Morley Cuidados Fellowship (a JR).

Materials

Name of the material Type Company Catalogue /
Model number
Comments
Air table equipment Newport
Air Pump equipment Newport ACGP
Pipette Puller equipment Sutter P-97
Borosilicate glass equipment WPI 1B150-4
Nikon Eclipse Inverted microscope equipment Nikon TE2000U Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least
Amplifier PC-501A equipment Warner 64-0008 Headstage 1 GΩ
Diamond knife Equipment Custom-made
Digitizer Mikro1401 A/D equipment Cambridge Electronic Design
Filter unit 3382 equipment Krohn Hite corporation
Signal software Cambridge Electronic Design
Molded Ag/AgCl Pellet equipment WPI 64-1297
Pipette holder equipment Warner 64-0997 Custom modified to fit
headstage
Recording chamber Equipment Custom-made
Micromanipulator
MP85-1028
equipment Sutter Instrument Micromanipulator
MP85-1028
Mineral oil Solution Sigma 330779-1L
Oscilloscope TDS 1001 equipment Tektronix
Three-barreled square glass tube Equipment Warner 64-0119 0.6 mm ID , 5 cm long
Valve equipment The Lee Company
Valvelink 8.2 equipment Automate Scientific
SF-77B Perfusion fast step equipment Warner

References

  1. Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
  2. Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
  3. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  4. Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
  5. Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
  6. Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
  7. Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
  8. Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
  9. Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
  10. Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
  11. Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).

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Cite This Article
Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R., Reisert, J. Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique. J. Vis. Exp. (62), e3862, doi:10.3791/3862 (2012).

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