Summary
Olfactorische receptor neuronen (ORNs) om te zetten geur signalen eerst in een receptor stroom die op zijn beurt actiepotentialen die worden overgebracht naar de tweede orde neuronen in de bulbus olfactorius triggers. Hier beschrijven we de zuig-pipet techniek om tegelijkertijd op te nemen van de geurstof-geïnduceerde receptor huidige en actiepotentialen van muis ORNs.
Abstract
Dieren proeven van de geurige omgeving om hen heen door de chemosensoring systemen in de neusholte. Chemosensoring signalen van invloed zijn complex gedrag zoals voedsel keuze, roofdier, soortgenoten en mate erkenning en andere maatschappelijk relevante cues. Olfactorische receptor neuronen (ORNs) bevinden zich in het dorsale deel van de neusholte ingebed in het reukepitheel. Deze bipolaire neuronen stuur een axon naar de bulbus olfactorius (zie Fig. 1, Reisert & Zhao 1, oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of algemene fysiologie) en uitbreiding van een enkele dendriet aan de epitheliale grens van waar trilharen uitstralen in het slijm dat de olfactorische dekt epithelium. De trilharen bevat de signaaltransductie machinerie die uiteindelijk leidt tot huidige instroom prikkelend door de ciliaire transductie kanalen, een cyclisch nucleotide-gated (CNG) kanaal en een Ca2 +-geactiveerde Cl - kanaal (Fig. 1). De daaruit voortvloeiende depolarization triggers actiepotentiaal generatie aan het cellichaam 2-4.
In deze video beschrijven we het gebruik van het "suction pipet techniek" naar geurstof-geïnduceerde responsen opnemen ORNs. Deze methode is oorspronkelijk ontwikkeld om op te nemen vanaf stang fotoreceptoren 5 en een variant van deze methode is te vinden op jove.com aangepast om op te nemen van de muis kegel fotoreceptoren 6. De zuig-pipet techniek werd later aangepast om ook op te nemen van ORNs 7,8. Kort na dissociatie van het reukepitheel en celisolatie wordt het gehele lichaam van een cel ORN gezogen in de punt van een pipet opname. De dendrieten en de cilia blijven blootgesteld aan de badoplossing en dus toegankelijk voor oplossing verandert om bijvoorbeeld geurstof of farmacologische blocker toepassing mogelijk. In deze configuratie is geen toegang tot de intracellulaire omgeving verkregen (no whole-cell voltage clamp) en de intracellulaire spanning blijft vrij variëren. Dit allesdankt het gelijktijdig opnemen van de langzame receptor stroom die afkomstig zijn van de cilia en snelle actie potentialen afgevuurd door het cellichaam 9. Het verschil in kinetiek tussen deze twee signalen kunnen ze worden gescheiden met verschillende instellingen weer. Deze techniek kan worden gebruikt op elk wild type of knockout muis of selectief opnemen ORNs die tegelijk GFP specifieke subsets van ORNs label, bijv. een gegeven expressie geurstof receptor of ionkanaal.
Protocol
1. De Opname-instelling
De opname kamer is gemonteerd op een Nikon Eclipse TE2000U omgekeerde microscoop met fasecontrast optica die is aangebracht op een lucht tafel en elektrisch afgeschermd met een Faraday kooi. De plexiglas opname kamer bestaat uit twee delen gedeeltelijk gescheiden door een barrière en gelijmd op een gesilaniseerde glasplaatje. Een deel van de kamer wordt gebruikt om de cellen te regelen terwijl de andere wordt gebruikt voor stimulus-blootstelling tijdens de opname voortijdige afgehandelde maar nog niet gebruikte cellen minimaliseren geurstof. De opname installatie bestaat uit een zuig pipet (zie hieronder) gemonteerd in een pipethouder pellets en een aardelektrode. De zuig pipet wordt gepositioneerd met een micromanipulator. Stimulus oplossingen worden toegepast met behulp van een triple-loop glazen vierkante buis, waarbij elke vierkante buis wordt 0,7 mm x 0,7 mm. De triple-barrel glas werd verbonden met een gemotoriseerde snel stap perfusie gemonteerd op een manipulator (Sutter SF-77B, Warner Instruments) en werd de opname kamer onder een hoek van 45 ° ~. Het einde van de triple vat glas is afgeschuind onder een hoek van 45 ° weer dat uiteindelijk vlak (opening) van de triple-vat glas was dicht verticale positionering van de pipet toe.
De zuig pipet elektrode gevuld met standaard zoogdieren Ringer oplossing en de aardelektrode verbonden tot 1 GΩ headstage een patch clamp-versterker (PC-501A, Warner Instruments) in spanningsklem mode. Het analoge signaal van de versterker (laagdoorlaat gefilterde bij 5 kHz) wordt weergegeven op een digitale oscilloscoop het signaal in real-time te volgen en ook verbonden met een 8-polig Bessel filter (Krohn-Hite) waar het signaal laagdoorlaat gefilterde bij 50 Hz. Beide signalen (laagdoorlaat gefilterde bij 5 kHz en 50 Hz) worden toegevoerd aan een A / D converter (Cambridge Electronic Design Micro 1401 mkII) die aan een PC voor data-acquisitie. De gegevens worden opgenomen met Signaal 3 ACQuisition software (Cambridge Electronic Design) bij een bemonsteringsfrequentie van 10 kHz. Het signaal wordt opgenomen op de twee verschillende bandbreedtes om eerst noteer de receptor huidige samen met de boven elkaar actiepotentialen en vervolgens de receptor huidige alleen (zie Fig. 2). De perfusie wordt gebruikt om snel tussen Ringer (controle) oplossing en geurstoffen stimuli of oplossing van gewenste samenstelling en wordt door de PC en software Signal 3. De oplossingen worden opgenomen in 60 ml spuiten en de stroomsnelheid wordt geregeld door medische kwaliteit intraveneuze debietregelaars. Typisch wordt het debiet ingesteld op 1 ml / min.
De zuigkracht van de opname pipet wordt geregeld als volgt: De zijpoort van de pipethouder is verbonden met een olieleiding die op zijn beurt is verbonden met een in hoogte verstelbare oliereservoir. Verhogen of verlagen reservoir zorgt ervoor dat de pipet druk staat en Ringer stroom door de punt van de pipette is minimaal en licht positief. Extra zuig-of druk kan worden toegepast door een buis verbonden met het luchtruim van het reservoir met een mondstuk aan het andere einde naar het cellichaam van een geïsoleerd ORN zuigen in de punt van de opname pipet.
De experimenten worden uitgevoerd bij 37 ° C om de natieve nabootsen fysiologische toestand van de cel. De temperatuur wordt geregeld door het passeren van de oplossingen door een maatwerk verwarmingseenheid die bestaat uit keramische weerstanden waardoor roestvrijstalen buizen bevattende de oplossingen worden gevoerd 10. De temperatuur wordt gecontroleerd met behulp van een thermokoppel thermometer (Fluke).
2. Oplossingen
Mammalian Ringer's oplossing (mM): 140 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 Glucose. De pH werd ingesteld op 7,5 met NaOH. Een 10% verdunde Ringer's oplossing werd gebruikt voor het meten van de huidige knooppunt. Odorant oplossingen: Acetofenon en eugenol werden dagelijks bereid in Ringer-oplossing van 20 mM DMSO voorraden.
3. Het maken van elektroden
- Plaats een unfilamented borosilicaatglas capillair in een Sutter P-97 micropipet trekker en trek een micropipet met een lange taps.
- Breng de pipet aan op een op maat gemaakte micropipet houder gemonteerd op een Nikon E200 Eclipse microscoop die op zijn beurt uitgerust met een dradenkruis in het oculair en een beweegbare diamant mes gemonteerd op het podium.
- Let op de punt van de pipet onder de 20x objectief en het gebruik van het dradenkruis als een gids, zachtjes schrijver de pipet in een hoek van 90 ° met behulp van de op maat gemaakte diamant mes waar de pipet is 10 micrometer breed (buitendiameter).
- Verder Verplaats de diamant mes in de richting van de punt en geleidelijk aan druk uit te oefenen op de punt met de diamant mes. De pipetpunt moet netjes breken op het punt waar het werd beschreven.
U kunt ook de stappen 3.1 tot en met3,4 kunnen worden gecombineerd en pipetten kan worden getrokken met de gewenste afmetingen direct zonder dat u de pipetpunt snijden, maar het kan bewijzen moeilijker om betrouwbare pipetten trekken met zo'n grote tip diameter en netjes afgesneden randen.
- Onder een 40x objectief, brand polijsten de punt van de pipet tot een inwendige diameter van 5 urn met een elektrisch verwarmde filament. Eenmaal klaar, de micropipet is klaar om te worden gebruikt voor het opnemen stromen van muis ORNs. De open pipet weerstand moet ongeveer 1 MW wanneer gevuld met Ringer.
4. Isolatie van olfactorische receptor neuronen
- Offer een muis volgen institutionele richtlijnen en regelgeving. Verwijder de kop, afpellen van de huid boven de schedel en mediaal het hoofd halveren langs de middellijn.
- Plaats de twee hemi-heads onder een dissectie stereomicroscoop, trek het neustussenschot en verwijder de olfactorische neusschelpen. Plaats alle weefsels in een petrischaal met glucose containing zoogdieren Ringer-oplossing.
- Schil de reukepitheel van de onderliggende kraakbeen van twee neusschelpen en breng het weefsel in een Eppendorf buis met 250 ul Ringer. We maken gebruik van weefsel van 2 neusschelpen om de juiste dichtheid van de cellen te krijgen voor de grootte van onze opname kamer. Bewaar de resterende weefsel bij 4 ° C voor later gebruik.
- Vortex de Eppendorf buis met het reukepitheel tweemaal kort op gedurende 1 sec met gemiddelde snelheid. Deze stap leidt tot mechanische dissociatie van het ORNs van het epitheel.
- Plaats de Ringer oplossing die het gedissocieerde ORNs in de opname kamer. Verwijderen van grote stukken weefsel ook in de suspensie aanwezig met fijne pincet.
- Laat de ORNs gedurende 20 minuten af te wikkelen voordat u begint met continue superfusie met Ringer en ga verder met de opnames.
5. Opnamen
- Laat de zuig-elektrode aangesloten op de olieleiding in de opname kamer en regulat de hoogte van het oliereservoir enigszins positieve druk vast te stellen op een pipetpunt. Dit kan worden gedaan door te kijken bijv. celresten stappen van (overdruk) of op (negatieve druk) de pipet. Probeer niet om de punt van de pipet besmetten met celresten.
- Scan de opname kamer voor een geïsoleerde ORN die kan worden herkend door zijn typische bipolaire morfologie met een vergroting van 20-40x. Verplaats de registratie-elektrode in de nabijheid van de ORN cellichaam. Voorzichtig beginnen zuigen, zodat de cel lichaam binnenkomt in de punt van de pipet. Voorzichtig en langzaam blijven afzuigen totdat de gehele cellichaam wordt getrokken in de punt van de pipet zuigkracht, waardoor de dendriet en cilia blootgesteld aan de badoplossing. Voor afbeeldingen van gezogen ORNs en pipet vormen zie 7,11. Zorg ervoor dat, zodra er geen zuigkracht wordt toegepast, de ORN niet beweegt in of uit de pipet. Zo ja, overeenkomstig de hoogte van het oliereservoir.
- Met demicromanipulators, beweegt u de zuig-pipet uit het gedeelte met de vaste ORNs om de opname gedeelte van de kamer. Plaats de zuig-pipet in de voorkant van de 3-barrelled buis voor oplossing uitwisseling. De zuig pipet moet worden geplaatst dicht genoeg bij de opening van de 3-barreled buis, zodat de ORN wordt blootgesteld aan een laminaire stroming zodat geen menging turbulentie en snelle oplossing bij kamertemperatuur bereiken. De oplossing wordt bereikt door uitwisseling stappen het grensvlak tussen parallelle stromen stromende oplossing in de punt van de pipet zuigkracht. Het tijdsverloop van de oplossing uitwisseling meestal tussen 20 ms, gemeten vanaf het kruispunt huidige opgeroepen door de stappen cel tussen oplossingen van verschillende ionische samenstelling (zie Fig. 2). Oplossingen worden geleverd door de zwaartekracht.
6. Representatieve resultaten
Figuur 1. A) receptor bipolaire neuronen in de bulbus olfactorius. B) Signaaltransductie machines in de trilharen leidt uiteindelijk tot prikkelend huidige instroom. De daaropvolgende depolarisatie activeert actiepotentiaal generatie aan het cellichaam.
Figuur 2 de snelheid en betrouwbaarheid van oplossing uitwisseling. Een pipet werd verhoogd van 10% naar normale verdunde Ringer gedurende 100 ms en het verbindingspunt stroom als gevolg van de ongelijke ionenconcentratie opgenomen. Zwarte spoor is het avewoede van 5 proeven, rode traceren zijn SD. De kleine verandering in SD tijdens de oplossing uitwisseling toont betrouwbaarheid van de oplossing uitwisseling van trial voor de rechter en het gebrek aan overtollige ruis in beide oplossingen stroom.
Figuur 3 een eugenol geïnduceerde reactie van een ORN met de zuig-pipet-techniek. De ORN werd blootgesteld aan 100 uM eugenol 1 seconde zoals aangegeven door de balk boven de opname. In Fig. 3A (zwart spoor) de receptor stroom werd gefilterd bij een bandbreedte 0 - 50 Hz om alleen de receptor huidige Fig.. 3B toont dezelfde opname nu gefiltreerd de grote bandbreedte van 0 - 5000 Hz (rood trace) ook weer actiepotentialen (AP, aangegeven door pijlen). De inzet toont hetzelfde spoor op een tijdschaal uitgebreid tot APs visualiseren duidelijker bij het begin van de reactie.
Figuur 4. Dosis-respons familie van een eugenol-responsieve ORN (A). Eugenol werd gebruikt bij een concentratie van 0,3 urn tot 100 urn, de stimulus duurde 1 s en sporen werden gefiltreerd bij 0 - 50 Hz. De geleidelijke verhoging van de concentratie geurstof heeft geleid tot een grotere en snellere respons, die ook beëindigd langzamer zodra geurstof blootstelling werd beëindigd.
ORNs kan weergeven van een oscillerende reactie patroon tijdens lange stimulaties op tussenliggende geurstof concentraties (Fig. 4B). Hier een acetephenone (3 uM) reageert ORN werd gestimuleerd gedurende 8 seconden. Na een snelle en voorbijgaande grootste gevoeligheid bij het begin van stimulatie een reeks kleinere, terugkerende responsen waargenomen. De opname bandbreedte was 0 - 50 Hz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH DC009613, het Human Frontier Science Program en een Morley Care Fellowship (naar JR).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
