Summary
Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.
Abstract
Hayvanlar burun boşluğunda bulunan kimyasal duyusal sistemleri aracılığıyla çevrelerindeki kokulu ortamda tadabilirsiniz. Kimyasal duyusal sinyaller gibi yiyecek seçimi, yırtıcı, conspecific ve eşini tanıma ve diğer sosyal ilgili ipuçları gibi karmaşık davranışları etkiler. Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) olfaktör epitel gömülü nazal kavite dorsal kısmında yer almaktadır. Bunlar bipolar nöronların (bkz. Şek. 1, başlangıçta Genel Fizyoloji Dergisi'nde yayınlanan Reisert & Zhao 1) koku ampul bir akson göndermek ve koku kaplayan mukus içine nereye kirpikler yayar gelen epitelyal sınırına tek bir dendrit uzatmak epitel. Kanal (Şekil 1) - tüyler sonuçta silier transdüksiyonu kanalları, siklik nükleotid-geçiş (CNG) kanal ve bir Ca2 + ile aktive Cl arasından akım akışına neden olmaktadır eksitatör sinyal transdüksiyonu amaçlı içerir. Ensuing depolazasyon hücre gövdesi 2-4 aksiyon potansiyeli oluşturma tetikler.
Bu videoda ORNs gelen odorant bağlı yanıtları kaydetmek için "emme pipet tekniği" kullanımını açıklar. Bu yöntem ilk çubuk fotoreseptör 5 kayıt yapmak geliştirilmiş ve bu yöntem bir varyantı fare koni fotoreseptör 6 kaydetmek için modifiye jove.com bulunabilir. Emme pipet tekniği daha sonra da ORNs 7,8 kayedetmek uyarlanmıştır. Kısaca, koku ve epitel hücre izolasyon ayrışma takiben, ORN, tüm hücre gövdesi bir kayıt pipet ucu içine çekilmektedir. Dendrit ve kirpikler banyo solüsyonu maruz ve örneğin odorant veya farmakolojik engelleyici uygulamayı etkinleştirmek için çözüm değişiklikleri böylece erişilebilir kalır. Bu yapılandırmada, intraselüler çevreye hiçbir erişim elde edilir (hayır tam hücreli gerilim kelepçe) ve hücre içi voltajı değişir serbest kalır. Bu, tümkirpikler ve hücre gövdesi 9 tarafından ateş hızlı aksiyon potansiyelleri de kaynaklanır yavaş reseptör akımı eş zamanlı kayıt OWS. Bu iki sinyal arasında kinetikleri farkı da farklı filtre ayarları kullanılarak ayrılması için olanak sağlar. Bu teknik, her vahşi tip ya da knockout farelerde kullanılabilir veya aynı zamanda ORNs belirli alt etiket GFP ifade ORNs dan seçici olarak kaydetmek için, örneğin, belirli bir odorant reseptör veya iyon kanalı eksprese eden.
Protocol
1. Kayıt Ayarı
Kayıt odasına bir hava masa üzerine takılan ve elektriksel bir Faraday kafesi kullanılarak korumalıdır faz kontrast optik ile Nikon TE2000U Eclipse inverted mikroskop üzerine monte edilir. Pleksiglas kayıt odasına iki bölümden kısmen bir bariyer ile ayrılmış ve bir Silanlanmış cam slayt üzerine yapıştırılmış oluşur. Odasının bir bölümü, diğer odorant için erken yerleşik maruz ancak henüz kullanılmamış hücreleri en aza indirmek için kayıt sırasında uyaran-poz için kullanılan en hücrelere yerleştirmek için kullanılır. Kayıt ayarları bir pelet pipet tutucu ve toprak elektrot monte emme pipet (aşağıya bakınız) oluşmaktadır. Emme pipet mikromanipülatör kullanılarak yerleştirilir. Stimulus çözümler her kare tüp 0,7 mm x 0,7 mm olmak üzere, üçlü-varil cam kare tüp kullanılarak uygulanır. Üçlü varil cam bir manipülatör üzerine monte edilmiş motorlu hızlı adım perfüzyon sistemi (Sut bağlandıter SF-77B, Warner Instruments) ve ~ 45 ° lik bir açı kayıt odasına girdi. Üçlü varil cam uç üçlü-varil cam nihai yüzü (açma) pipetin yakın konumlandırılması izin vermek için dikey olarak bu tür tekrar 45 ° 'lik bir açı ile eğimli edildi.
Standart memeli Ringer solüsyonu ve toprak elektrotu ile dolu emme pipet elektrot voltaj kelepçesi modda bir yama klemp amplifikatörü 1 GΩ headstage (PC-501A, Warner Instruments) ile bağlanır. Amplifikatör (düşük geçiş 5 kHz'de süzülmüş) gelen analog sinyal gerçek zamanlı olarak sinyalinin izlenmesi için bir dijital osiloskop gösterilen ve aynı zamanda sinyal geçiş filtre edilmiş düşük olan bir 8-kutuplu Bessel filtresi (Krohn-Hite) bağlanır 50 Hz. Her iki sinyal (5 kHz ve 50 Hz alçak geçiren filtre) veri toplama için bir bilgisayara bağlı bir A / D dönüştürücü (Cambridge Elektronik Tasarım Micro 1401 mkII) beslenir. Veri Sinyal 3 ACQ kullanılarak kaydedilir10 kHz örnekleme frekansında uisition yazılımı (Cambridge Elektronik Tasarım). Sinyali ilk olarak üst üste aksiyon potansiyeli ile birlikte akım reseptörü ve daha sonra tek başına akım reseptörü (bakınız Şek. 2) tespit etmek için iki farklı bant genişlikleri de kaydedilir. Perfüzyon sistemi Ringer (kontrol) çözüm ve odorant uyaranlar veya istediğiniz kompozisyonu herhangi bir çözüm arasında hızla geçiş yapmak için kullanılır ve PC ve Sinyal 3 yazılım tarafından kontrol edilir. Çözümler 60 ml şırınga içinde bulunan ve akış hızı tıbbi dereceli intravenöz akış düzenleyiciler ile kontrol edilir. Tipik olarak, akış hızı 1 ml / dakika olarak ayarlanır.
Kayıt pipet üzerinde emme aşağıdaki biçimde kontrol edilir: pipet tutucu yan bağlantı noktası da yüksekliği ayarlanabilir bir yağ rezervuar bağlı olan bir yağ hattı bağlanmıştır. Yükseltilmesi ya da düşürülmesi rezervuar sağlar ki p pipet ucu ile basınç ve bu nedenle Ringer akımipette minimal ve hafif olumlu. İlave ya da emme basıncı kayıt pipet ucu içine izole edilmiş bir ORN bir hücre gövdesi emmek için diğer ucunda ağızlık ile rezervuar sahası bağlı bir tüp aracılığıyla uygulanabilir.
Deneyler ° C'ye yakın bir hücrenin doğal fizyolojik durumu simüle etmek amacıyla, 37 gerçekleştirilir. Sıcaklık çözümleri içeren paslanmaz çelik tüpler 10, üzerinden geçirilir seramik direnç oluşan bir ısmarlama bir ısıtıcı birim vasıtasıyla çözüm geçen tarafından kontrol edilir. Sıcaklığı termokupl termometre (Fluke) kullanılarak izlenir.
2. Çözümler
Memeli Ringer solüsyonu (mM): NaCI 140, KCI 5, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 0.01 EDTA, 10 HEPES, 10 glikoz. PH NaOH ile 7.5 'e ayarlandı. % 10 nispi Ringer çözeltisi birleşme akımı ölçmek için kullanılmıştır. Odorant çözümler: Asetofenon ve eugenol 20 mM DMSO stoklarından Ringer çözeltisi günlük olarak hazırlanmıştır.
3. Elektrotlar Yapımı
- Bir Sutter P-97 mikropipet çektirmesi kılcal bir unfilamented borosilikat cam yerleştirin ve uzun konik bir mikropipet çekin.
- Mercek ve sahne üzerine monte edilmiş hareketli elmas bıçak bir retikül ile donatılmıştır sırayla bir Nikon E200 Eclipse mikroskop üzerine monte ısmarlama bir mikropipet tutucu pipet aktarın.
- 20x hedefi altında pipet ucu gözlemleyin ve retikül bir kılavuz olarak kullanarak; yavaşça kâtip pipet 10 mikron genişliğinde (dış çap) olduğu ısmarlama elmas bıçak kullanarak 90 ° açıyla pipet.
- Ucuna doğru daha da elmas bıçak taşı ve kademeli elmas bıçakla ucunda basınç uygulayın. Pipet ucu tarif edildi noktada temiz ayrılmalıyız.
Alternatif olarak 3.1 adımları3.4 kombine edilebilir ve böyle bir büyük uç çapı ve temiz kesim kenarları ile güvenilir pipetler çekmek için daha zor kanıtlayabilirim rağmen pipetler, doğrudan pipet ucu kesmek zorunda kalmadan istediğiniz boyutları ile çekilebilir.
- Bir 40x hedefi kapsamında, bir elektrikle ısıtılan filaman kullanan 5 mikron bir iç çapa pipet ucu lehçe ateş. Bittiği zaman, mikropipet fare ORNs gelen kayıt akımları için kullanılmak üzere hazırdır. Ringer ile dolu olduğunda açık bir pipet direnç 1 MQ civarında olmalıdır.
4. Olfaktör Reseptör Nöronlar İzolasyonu
- Kurumsal düzenlemeler ve yönetmelikleri takip fare Kurban. , Baş kaldır sıyırın cilt kafatasını örten ve medial orta hat boyunca kafasını ikiye bölmek.
- Diseksiyon stereomikroskop altında iki hemi-kafa yerleştirin, nazal septum koparmak ve koku konkalar çıkarın. Glukoz c ile bir Petri kabındaki tüm doku yerleştirinMemeli Ringer solüsyonu ontaining.
- İki konkalar gelen Altta bulunan kıkırdak kapalı olfaktör epitel soyun ve 250 ul Ringer içeren bir Eppendorf tüp içine doku transferi. Biz kayıt odasının boyutları için hücrelerin sağındaki yoğunluğu elde etmek için 2 konka doku kullanın. ° C daha sonra kullanmak için 4 de kalan doku saklayın.
- Orta hızda 1 saniye boyunca iki kez kısaca olfaktör epitel içeren Vorteks Eppendorf tüp. Bu adım, epitel ORNs mekanik ayrışma yol açar.
- Kayıt odasında ayrışmış ORNs içeren Ringer solüsyonu yerleştirin. Ince forseps kullanarak süspansiyonda da mevcut doku büyük parçalarını çıkarın.
- ORNs Ringer sürekli superfusion başlamadan önce 20 dakika boyunca yerleşmek ve kayıtları devam edelim.
5. Kayıtlar
- Kayıt odasına ve Regul içine yağ hattına bağlı emme elektrotu Altpipet ucu hafifçe pozitif basınç oluşturmak için yağ haznesinin yüksekliği yedik. Bu pipetle (pozitif basınç) veya (negatif basınç) uzağa doğru hareket eden örneğin hücre artıkları gözlemlenerek yapılmaktadır. Hücre artıkları ile pipet ucu kontamine çalışın.
- 20-40x bir büyütme kullanarak tipik bipolar morfolojisi tarafından kabul edilebilir bir izole ORN için kayıt odasına tarayın. ORN hücre vücudun yakın içine kayıt elektrodu taşıyın. Yavaşça hücre gövdesi pipet ucu girer böylece emmeye başlar. Yavaş ve dikkatli bir bütün hücre gövdesi banyo çözeltisine maruz dendrit ve kirpikler bırakarak, emme pipet ucu içine çekilir kadar emme uygulanmaya devam eder. Sucked ORNs Pipet ve biçimlere ait görüntüler için 7,11 bkz. Emme yok, bir kez uygulandığında, ORN pipet hareket ya da dışarı gelmez emin olun. Bu durumda, buna göre yağ rezervuar yüksekliğini ayarlamak.
- Kullanmamikromanipülatörler, odanın kayıt bölümünde yerleşik ORNs içeren bölüm gelen emme pipet hareket eder. Çözelti değişimi için 3-namlulu tüp önünde emme pipet dikkatli bir şekilde yerleştirin. ORN böylece karıştırma sarsıntıları önleyen bir laminer akış maruz kalmışsa ve hızlı çözüm döviz elde etmek, böylece emiş pipet yeterince yakın 3 namlulu tüpünün açılması konulmalıdır. Çözelti değişimi emme pipet ucu boyunca akan çözelti paralel akış arasındaki ara basamak ile elde edilir. Çözümü değişim zamanı ders genellikle farklı iyonik kompozisyon çözümleri arasındaki hücre (bkz. Şek. 2) atlama tarafından uyarılmış kavşağından mevcut ölçülen yaklaşık 20 ms olduğunu. Çözümler yerçekimi tarafından teslim edilir.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. Koku ampul A) Bipolar reseptör nöronları. B) kirpikler içinde sinyal transdüksiyonu amaçlı nihai akım akışı eksitatör yol açar. Izleyen depolarizasyon hücre gövdesinde aksiyon potansiyeli oluşturma tetikler.
Şekil 2, çözelti değişimi hızı ve güvenilirliği gösterir. Bir pipet 100 ms ve farklı iyon konsantrasyonu kaynaklanan kavşak mevcut kaydedildi% 10 sulandırılmış Ringer içine normalden adım atıldı. Siyah iz ave olduğunu5 çalışmaların öfke, kırmızı onun SD iz. Çözüm değişim sırasında SD küçük bir değişiklik deneme deneme ve çözüm akarsu ya aşırı gürültü olmaması çözüm Döviz güvenilirliğini ispatlıyor.
Şekil 3, emme pipet tekniği kullanılarak bir ORN bir öjenol bağlı tepki gösterir. Kayıt üstündeki çubuğu tarafından belirtildiği gibi ORN 1 saniye için 100 mcM eugenol maruz kalmıştır. Şek. Sadece mevcut reseptörüne görüntülemek için 50 Hz Şekil - 3A (siyah iz) reseptör mevcut bant genişliği, 0 süzüldü.. 5000 Hz (kırmızı iz) de aksiyon potansiyelleri (oklarla gösterilen AP), görüntülemek için - 3B şimdi 0 geniş bant aralığında filtre aynı kayıt gösterir. Ilave tepki başlangıcında, daha açık bir şekilde AP görselleştirmek için genişletilmiş bir zaman ölçeği de aynı eser göstermektedir.
Bir öjenol-duyarlı ORN Şekil 4. Doz-tepki aile (A). Eugenol 0.3 uM ila 100 uM arasında değişen konsantrasyonlarda kullanılan, uyaran süresi 1 sn oldu ve izleri 0 süzülmüş edildi - 50 Hz. Odorant konsantrasyonu ilerleyen artışa odorant pozlama sonlandırıldı kez de daha yavaş sona daha büyük ve daha hızlı yanıt yol açtı.
ORNs ara odorant konsantrasyonları (Şekil 4B) itibariyle uzun uyarımlar esnasında salınımlı yanıtı desenini görüntüleyebilirsiniz. İşte bir acetephenone (3 uM) duyarlı ORN 8 saniye uyarıldı. Stimülasyon başlangıcında hızlı ve geçici pik cevaptan sonra küçük, yinelenen yanıtları bir dizi izlenir. 50 Hz - Kayıt bant genişliği 0 oldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH DC009613, İnsan Sınır Bilim Programı ve Morley Bakım Bursu (JR) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
