Summary

Odorant induites réponses enregistrées à partir de neurones récepteurs olfactifs en utilisant la technique de la pipette d'aspiration

Published: April 05, 2012
doi:

Summary

Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) convertir les signaux d'odeurs dans un premier récepteur de courant qui à son tour déclenche des potentiels d'action qui sont acheminés à des neurones de second ordre dans le bulbe olfactif. Ici, nous décrivons la technique pipette d'aspiration d'enregistrer simultanément le récepteur olfactif courant induit et des potentiels d'action de ORNs souris.

Abstract

Animaux échantillonner l'environnement odorant autour d'eux à travers les systèmes chimiorécepteurs situés dans la cavité nasale. Signaux chimiosensoriels affectent les comportements complexes tels que le choix des aliments, prédateur, conspécifiques et la reconnaissance compagnon et d'autres indices socialement pertinents. Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) sont situés dans la partie dorsale de la cavité nasale noyée dans l'épithélium olfactif. Ces neurones bipolaires envoyer un axone vers le bulbe olfactif (voir Fig. 1, Reisert & Zhao 1, initialement publié dans le Journal of General Physiology) et d'étendre une dendrite unique à la frontière épithéliales de rayonner cils où dans le mucus qui recouvre la olfactif épithélium. Les cils contenir le mécanisme de transduction du signal qui mène à excitateurs afflux de courant à travers les canaux de transduction ciliaire, un nucléotide cyclique-dépendant (CNG) et un canal de Ca 2 +-Cl actif canal (Fig. 1). Le depola qui a suivirisation déclenche la génération du potentiel d'action sur le corps 2-4 Cellules.

Dans cette vidéo, nous décrivons l'utilisation de la "technique d'aspiration pipette" pour enregistrer odorant réponses induites à partir ORNs. Cette méthode a été développée à l'origine pour enregistrer à partir photorécepteurs à bâtonnets 5 et une variante de cette méthode peut être trouvé à jove.com modifié pour enregistrer à partir de cônes photorécepteurs de souris 6. La technique pipette d'aspiration a été adapté plus tard pour également enregistrer à partir ORNs 7,8. Brièvement, après dissociation de l'épithélium olfactif et d'isolement des cellules, le corps de la cellule entière d'une ORN est aspiré dans la pointe de la pipette d'enregistrement. La dendrite et les cils restent exposées à la solution de bain et donc accessible à des changements de solution pour permettre par exemple odorant ou une application de blocage pharmacologique. Dans cette configuration, pas d'accès à l'environnement intracellulaire est acquise (pas de blocage de tension de cellule entière) et la tension intracellulaire reste libre de varier. Tout celaux l'enregistrement simultané du courant qui provient du récepteur lent à des cils et des potentiels d'action rapide tiré par le corps 9 cellules. La différence de cinétique entre ces deux signaux permet de les séparer en utilisant différents paramètres de filtre. Cette technique peut être utilisée sur n'importe quel type sauvage ou de la souris knock-out ou d'enregistrer de manière sélective à partir ORNs qui expriment la GFP également d'étiqueter des sous-ensembles spécifiques de ORNs, par exemple, l'expression d'un récepteur olfactif donnée ou canal ionique.

Protocol

1. La Recording Setup La chambre d'enregistrement est montée sur un microscope inversé Nikon Eclipse TE2000U avec optique à contraste de phase qui est monté sur une table pneumatique et électrique blindé avec une cage de Faraday. La chambre d'enregistrement Plexiglas compose de deux sections partiellement séparés par une barrière et collé sur une lame de verre silanisée. Une section de la chambre est utilisée pour régler les cellules tandis que l'autre est utilisé pou…

Discussion

<p class="jove_content"> La technique pipette d'aspiration est une méthode électrophysiologique qui est utilisé pour enregistrer le courant induit par l'odeur récepteur lent et les potentiels d'action rapide biphasiques à partir d'un ORN simultanément. Depuis la membrane plasmique de la cellule ne soit pas dépassé, cette méthode laisse le milieu intracellulaire non perturbé en sorte que les réponses odorantes ne sont pas altérées en raison de changements des concentrations d'ions cytoplasmiques ou de dilution…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le NIH DC009613, le Programme des sciences humaines frontières et Morley soins de bourse (JR).

Materials

Name of the material Type Company Catalogue /
Model number
Comments
Air table equipment Newport
Air Pump equipment Newport ACGP
Pipette Puller equipment Sutter P-97
Borosilicate glass equipment WPI 1B150-4
Nikon Eclipse Inverted microscope equipment Nikon TE2000U Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least
Amplifier PC-501A equipment Warner 64-0008 Headstage 1 GΩ
Diamond knife Equipment Custom-made
Digitizer Mikro1401 A/D equipment Cambridge Electronic Design
Filter unit 3382 equipment Krohn Hite corporation
Signal software Cambridge Electronic Design
Molded Ag/AgCl Pellet equipment WPI 64-1297
Pipette holder equipment Warner 64-0997 Custom modified to fit
headstage
Recording chamber Equipment Custom-made
Micromanipulator
MP85-1028
equipment Sutter Instrument Micromanipulator
MP85-1028
Mineral oil Solution Sigma 330779-1L
Oscilloscope TDS 1001 equipment Tektronix
Three-barreled square glass tube Equipment Warner 64-0119 0.6 mm ID , 5 cm long
Valve equipment The Lee Company
Valvelink 8.2 equipment Automate Scientific
SF-77B Perfusion fast step equipment Warner

References

  1. Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
  2. Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
  3. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  4. Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
  5. Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
  6. Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
  7. Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
  8. Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
  9. Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
  10. Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
  11. Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).

Play Video

Cite This Article
Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R., Reisert, J. Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique. J. Vis. Exp. (62), e3862, doi:10.3791/3862 (2012).

View Video