Summary

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

Published: April 05, 2012
doi:

Summary

נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.

Abstract

בעלי חיים לטעום הסביבה הריחנית סביבם דרך מערכות chemosensory ממוקמות בחלל האף. אותות Chemosensory להשפיע התנהגויות מורכבות כגון בחירת אוכל, טורף, conspecific והכרת בן זוג ורמזים חברתיים רלוונטיים אחרים. נוירונים קולטניים ריח (ORNs) ממוקמים בחלק הגבה של חלל האף המוטבע באפיתל ההרחה. הנוירונים דו קוטביים אלו שולחים אקסון לנורת חוש הריח (ראה איור. 1, Reisert & זאו 1, שפורסם במקור בכתב העת של פיזיולוגיה כללית) ולהרחיב דנדריט אחת לגבול אפיתל ממקום שבי להקרין ריסים לליחה המכסה את חוש הריח האפיתל. הריסים מכילים מנגנון העברת האותות שסופו של דבר מוביל לגירוי זרם זרם דרך ערוצי ריסי transduction, ערוץ מחזורי נוקלאוטיד-מגודר (CNG) וCa 2 +-Cl פעיל ערוץ (1 איור). Depola התפתחrization מפעיל דור פוטנציאל פעולה בגוף התא 2-4.

בסרטון זה אנו מתארים את השימוש של "טכניקת יניקת פיפטה" לרשום תגובות odorant מושרים מORNs. שיטה זו פותחה במקור כדי להקליט מphotoreceptors המוט 5 וריאנט של שיטה זו ניתן למצוא בjove.com השונה כדי להקליט מphotoreceptors קונוס העכבר 6. טכניקת יניקת פיפטה מאוחר יותר הותאם גם להקליט מORNs 7,8. בקצרה, לאחר הניתוק של האפיתל ההרחה ובידוד תא, גוף התא כולו של orn נשאב לתוך קצה פיפטה הקלטה. דנדריט והריסים יישארו חשוף לפתרון אמבטיה ובכך נגיש לשינויי פתרון שיאפשר odorant למשל או יישום חוסם תרופתי. בתצורה זו, אין לו גישה לסביבה התאית היא צברה (לא מהדק מתח כל תאים) והמתח התאי נותר חופשי להשתנות. כל זהows ההקלטה סימולטני של זרם הקולט האיטי שמקורו בריסים ופוטנציאל פעולה מהיר שנורה על ידי גוף התא 9. ההבדל בקינטיקה בין שני אותות אלה מאפשר להם להיות מופרדים באמצעות גדרות מסננות שונות. טכניקה זו ניתן להשתמש בכל סוג פרא או עכבר נוקאאוט או להקליט באופן סלקטיבי מORNs שגם מבטא GFP לתייג תת ספציפי של ORNs, למשל מבטא קולט odorant נתון או ערוץ יון.

Protocol

1. הגדרת ההקלטה חדר ההקלטה הוא רכוב על המיקרוסקופ ניקון TE2000U אקליפס הפוך עם אופטיקה לעומת השלב בו מצויד על שולחן אוויר וחשמל מוגן באמצעות כלוב פאראדיי. חדר הקלטת פרספקס מורכב משני חלקים מופרדים באופן חלקי על ידי מחסום והודבק על גבי …

Discussion

<p class="jove_content"> טכניקת יניקת פיפטה היא שיטת אלקטרו שמשמש להקלטה נוכחי ריח המושרה האיטיים הקולטן ואת פוטנציאל הפעולה פאזית המהיר מorn בו זמנית. מאז קרום הפלזמה של התא לא נסדק, שיטה זו מותירה סביבה באין מפריע התאית להבטיח שתגובות odorant אינן משתנית בשל שינויים של ריכוזי cytoplasmic יון או הדילול של גורמים תאיים. ת?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH DC009613, תכנית מדע הגבולות האנושית ומוראלית טיפול מלגה (לJR).

Materials

Name of the material Type Company Catalogue /
Model number
Comments
Air table equipment Newport
Air Pump equipment Newport ACGP
Pipette Puller equipment Sutter P-97
Borosilicate glass equipment WPI 1B150-4
Nikon Eclipse Inverted microscope equipment Nikon TE2000U Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least
Amplifier PC-501A equipment Warner 64-0008 Headstage 1 GΩ
Diamond knife Equipment Custom-made
Digitizer Mikro1401 A/D equipment Cambridge Electronic Design
Filter unit 3382 equipment Krohn Hite corporation
Signal software Cambridge Electronic Design
Molded Ag/AgCl Pellet equipment WPI 64-1297
Pipette holder equipment Warner 64-0997 Custom modified to fit
headstage
Recording chamber Equipment Custom-made
Micromanipulator
MP85-1028
equipment Sutter Instrument Micromanipulator
MP85-1028
Mineral oil Solution Sigma 330779-1L
Oscilloscope TDS 1001 equipment Tektronix
Three-barreled square glass tube Equipment Warner 64-0119 0.6 mm ID , 5 cm long
Valve equipment The Lee Company
Valvelink 8.2 equipment Automate Scientific
SF-77B Perfusion fast step equipment Warner

References

  1. Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
  2. Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
  3. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  4. Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
  5. Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
  6. Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
  7. Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
  8. Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
  9. Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
  10. Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
  11. Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).

Play Video

Cite This Article
Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R., Reisert, J. Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique. J. Vis. Exp. (62), e3862, doi:10.3791/3862 (2012).

View Video