Summary
Luktreceptorceller neuroner (Örns) omvandlar lukt signaler först till en receptor ström som i sin tur utlöser aktionspotentialer som förmedlas till andra ordningens neuron i luktbulben. Här beskriver vi tekniken sug pipett för att spela in samtidigt luktämnen-inducerad receptor ström och potentialer åtgärder från mus Örns.
Abstract
Djur prov på illaluktande miljön omkring dem genom chemosensory system som finns i näshålan. Chemosensory signaler påverkar komplexa beteenden såsom mat val, rovdjur, conspecific och mate erkännande och andra socialt relevanta ledtrådar. Luktreceptorceller neuroner (Örns) ligger i den dorsala delen av näshålan inbäddad i luktepitel. Dessa bipolära nervceller skickar ett axon till luktloben (se Fig. 1, Reisert & Zhao 1, ursprungligen publicerad i Journal of General Physiology) och utöka en enda dendrit till epiteliala gränsen där Cilia stråla in i slem som täcker lukt epitel. Flimmerhåren innehåller maskinen signaltransduktion som slutligen leder till excitatoriska nuvarande inflöde genom ciliära transduktion kanaler, en cyklisk nukleotid-gated (CNG) kanal och en Ca 2 +-aktiverad CL - kanal (bild 1). Den påföljande depolarization triggar aktionspotentialen generationen på cellkroppen 2-4.
I den här videon beskriver vi användningen av "sug pipett teknik" för att spela in luktämne-inducerade svar från Örns. Denna metod utvecklades ursprungligen för att spela in från spö fotoreceptorer 5 och en variant av denna metod kan hittas på jove.com modifierats för att spela in från fotoreceptorer mus kon 6. Sug pipett Tekniken anpassades senare att även spela in från Örns 7,8. Kortfattat, efter dissociation av luktepitel och cellisolering, är hela cellkroppen av en ORN sugs in i spetsen av en inspelning pipett. Den dendrit och flimmerhåren förblir exponerade till badlösningen och därmed tillgänglig för lösning ändras för att möjliggöra t.ex. luktämne eller farmakologisk blockerare applikation. I denna konfiguration är ingen tillgång till den intracellulära miljön fått (ingen hel-cellspänning klämma) och den intracellulära spänningen förblir fri att variera. Detta alltows samtidig inspelning av den långsamma receptorn ström som har sitt ursprung i flimmerhåren och snabba potentialer åtgärder eldas med cellkroppen 9. Skillnaden i kinetik mellan dessa två signaler medger att de kan separeras med användning av olika filter inställningar. Denna teknik kan användas på alla vildtyp eller knockout-mus eller att spela selektivt från Örns som också uttrycker GFP att märka specifika undergrupper av Örns, t.ex. uttrycker en given luktreceptor eller jonkanal.
Protocol
1. Inspelning Inställning
Inspelningen kammaren monterad på en Nikon Eclipse TE2000U inverterat mikroskop med faskontrastoptik som är monterad på ett luftbord och elektriskt skärmade med användning av en Faraday-bur. Den Plexiglas inspelning kammare består av två sektioner delvis separerade av en barriär och limmas på en silaniserat objektglas. En del av kammaren används för att reglera cellerna medan den andra används för stimulus-exponering under inspelningen för att minimera tidig exponering av fast men ännu oanvända celler luktämne. Inspelningen inställning består av en sug pipett (se nedan) är monterad i en pelleterad pipetthållare och en jordelektrod. Sug pipett placeras med en mikromanipulator. Stimulans lösningar appliceras med en trippel-fat rör glas torg, där varje fyrkantsrör är 0,7 mm x 0,7 mm. Triple-fat glas anslöts till en motordriven snabbt steg perfusionssystem monterad på en manipulator (SutTER SF-77B, Warner Instruments) och in i inspelningen kammaren vid en vinkel på ~ 45 °. Slutet av den trippel fat glaset avfasade med en vinkel av återigen 45 ° så att den slutliga ytan (öppning) för trippel-fat glas var vertikalt för att möjliggöra nära positionering av pipetten.
Sug pipett elektroden fylld med standard däggdjur Ringer-lösning och jordelektroden är anslutna till 1 GΩ huvudsteg av en patch-clamp-förstärkare (PC-501A, Warner Instruments) i spänningsklämma läge. Den analoga signalen från förstärkaren (lågpassfiltreras vid 5 kHz) visas på ett digitalt oscilloskop för att övervaka signalen i realtid och även ansluten till en 8-polig Bessel-filter (Krohn-Hite) där signalen är lågpassfiltrerad vid 50 Hz. Båda signalerna (lågpassfiltreras vid 5 kHz och 50 Hz) matas in i en A / D-omvandlare (Cambridge Electronic Design 1401 Micro mkII) som är ansluten till en dator för datainsamling. Uppgifterna registreras med Signal 3 ACQuisition programvara (Cambridge Electronic Design) vid en samplingsfrekvens av 10 kHz. Signalen registreras vid de två olika bandbredder att först registrera receptorn strömmen tillsammans med de överlagrade aktionspotentialer och sedan receptorn strömmen ensamt (se figur. 2). Perfusionssystemet används för att växla snabbt mellan Ringer (kontroll)-lösning och stimuli odorant eller lösning av önskad komposition och styrs av datorn och Signal 3 programvara. Lösningarna finns i 60 ml sprutor och flödeshastigheten styrs av medicinsk kvalitet intravenösa flödesregulatorer. Typiskt är flödeshastigheten satt till 1 ml / min.
Den sugning på inspelningen pipetten styrs på följande sätt: Den sida port pipetthållaren är ansluten till en oljeledning, som i sin tur är ansluten till en höjd-justerbar oljereservoar. Höja eller sänka reservoaren säkerställer att pipetten trycket och därmed Ringers flöde genom spetsen av pipette är minimal och något positivt. Ytterligare sug eller tryck kan appliceras genom en slang ansluten till luftrummet i reservoaren med ett munstycke vid den andra änden för att suga cellkroppen av en isolerad ORN i spetsen av inspelningen pipetten.
Experimenten utförs vid 37 ° C för att noggrant simulera den nativa fysiologiska tillståndet hos cellen. Temperaturen styrs genom att leda lösningarna genom en skräddarsydd uppvärmningsenhet som består av keramiska motstånd genom vilka rostfria rör innehållande lösningarna passerade 10. Temperaturen övervakas med ett termoelement termometer (Fluke).
2. Lösningar
Däggdjurs Ringers lösning (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCb 2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 glukos. PH justerades till 7,5 med NaOH. En 10% utspädd Ringers lösning användes för att mäta strömmen korsningen. Odorant lösningar: acetofenon och eugenol bereddes dagligen i Ringers lösning från 20 mm DMSO aktier.
3. Göra Elektroder
- Placera en unfilamented borosilikatglas kapillär i en Sutter P-97 mikropipett avdragare och dra en mikropipett med en lång kona.
- Överför pipetten till en skräddarsydd mikropipett hållare monterad på en Nikon E200 Eclipse mikroskop som i sin tur försedd med ett hårkors i okularet och en rörlig diamant kniv monterad på scenen.
- Beakta pipettspetsen under 20x objektiv och använder riktmedel som en guide, försiktigt skriftlärd pipetten i en 90 ° vinkel med den skräddarsydda diamant kniv där pipetten är 10 um bred (ytterdiameter).
- Flytta diamantkniv vidare mot spetsen och gradvis sätta press på spetsen med diamant kniv. Pipettspetsen ska bryta rent vid den punkt där den ritsades.
Alternativt steg 3,1 till3,4 kan kombineras och pipetter kan dras med önskade dimensioner direkt utan att behöva skära pipettspetsen, även om det kan visa sig svårare att dra tillförlitligt pipetter med en sådan stor spetsdiameter och rent skurna kanter.
- Under en 40x objektiv, brand polera pipettspetsen till en inre diameter på 5 um med hjälp av en elektriskt uppvärmd glödtråd. När du är klar är det mikropipett redo att användas för inspelning strömmar från mus Örns. Den öppna pipett motstånd bör vara cirka 1 MQ när den är fylld med Ringers.
4. Isolering av luktreceptorceller nervceller
- Offra en mus efter institutionella riktlinjer och regler. Ta bort huvudet, dra bort huden överliggande skallen och medialt HALVERA huvudet längs mittlinjen.
- Placera två hemi-huvuden under en dissekera stereomikroskop, dra av nässkiljeväggen och ta bort lukt näsmusslorna. Placera alla vävnader i en petriskål med glukos containing däggdjur Ringer-lösning.
- Skala luktepitel från den underliggande brosk från två näsmusslorna och överföra vävnaden till ett Eppendorf-rör innehållande 250 ^ Ringer. Vi använder vävnad från 2 näsmusslorna att få rätt täthet av celler för storleken på vår inspelning kammare. Förvara den kvarvarande vävnaden vid 4 ° C för senare användning.
- Vortexa Eppendorfrör innehåller luktepitel snabbt två gånger i 1 sek vid medelhög hastighet. Detta steg leder till mekanisk dissociation av Örns från epitelet.
- Placera Ringer-lösning som innehåller de dissocierade Örns i inspelningen kammaren. Avlägsna stora vävnadsbitar också närvarande i suspension med användning av fin pincett.
- Låt Örns nöja 20 minuter innan kontinuerlig superfusion med Ringer och gå vidare till inspelningarna.
5. Inspelningar
- Sänk sug elektroden är ansluten till oljeledningen i inspelningen kammaren och Regulåt höjden på oljebehållaren att etablera svagt positivt tryck vid pipettspetsen. Detta kan göras genom att observera t.ex. cellrester rör sig bort från (positivt tryck) eller mot (negativt tryck) i pipetten. Försök att inte förorena pipettspetsen med celldebris.
- Skanna inspelningen kammaren för en isolerad ORN som kan kännas igen av dess typiska bipolär morfologi med en förstoring av 20-40x. Flytta inspelningen elektroden i närheten av ORN cellkroppen. Försiktigt börja suga så att cellkroppen kommer in i pipettspetsen. Försiktigt och långsamt fortsätta att anbringa sug tills hela cellkroppen dras in i spetsen av pipetten sug, lämnar dendrit och cilier exponerades till badlösningen. För bilder på suger Örns och former pipett se 7,11. Säkerställ att när inget sug anbringas, tänker ORN inte flytta in eller ut ur pipetten. Om så är fallet, justera höjden oljereservoaren därefter.
- Användamikromanipulatorer, flytta sug pipett från sektionen innehåller de bofasta Örns till inspelningen delen av kammaren. Placera försiktigt sug pipett framför 3-pipa rör för lösning utbyte. Sug pipett bör placeras tillräckligt nära öppningen av 3-pipa röret så att ORN utsätts för ett laminärt flöde därmed undvika blandning turbulens och uppnå snabb lösning utbyte. Lösningen utbytet uppnås genom att stega gränssnittet mellan parallella strömmar av flödande lösning över spetsen av sug pipetten. Tidsförloppet för lösningen utbytet är typiskt omkring 20 ms, mätt från korsningen ström framkallad genom att stega cellen mellan lösningar av olika jonsammansättning (se Fig. 2). Lösningar levereras av tyngdkraften.
6. Representativa resultat
Figur 1. A) Bipolära receptor nervceller i luktbulben. B) Signaltransduktion maskiner i flimmerhåren leder slutligen till excitatoriska aktuell inflöde. Den påföljande depolarisation utlöser aktionspotential generationen på cellkroppen.
Figur 2 visar hastigheten och tillförlitligheten av lösning utbyte. En pipett trappades från normal till 10% utspädd Ringer för 100 ms och korsningen strömmen till följd av olik jonkoncentrationen registrerades. Svart spår är averaseri av 5 försök, röd spåra dess SD. Den lilla förändringen i SD under lösningen utbytet visar tillförlitlighet lösning utbyte från rättegång till rättegång och bristen på överskjutande buller i antingen lösning ström.
Figur 3 visar ett eugenol-inducerat svar från en ORN användning av tekniken sug pipetten. Den ORN exponerades för 100 | iM Eugenol under 1 sekund såsom indikeras av stapeln ovanför inspelningen. I figur. 3A (svart spår) var receptorn ström filtreras vid en bandbredd från 0 till 50 Hz endast visa receptorn aktuella Fig... 3B visar samma inspelning, nu filtreras vid den breda bandbredd från 0 till 5000 Hz (röd kurva) för att också visa aktionspotentialer (AP, anges med pilar). Den infällda bilden visar samma kurva vid en expanderad tidsskala att visualisera AP tydligare vid början av svaret.
Figur 4. Dosrespons familj en eugenol-responsiv ORN (A). Eugenol användes vid koncentrationer som sträcker sig från 0,3 pM till 100 pM, var stimulus varaktighet 1 s och spår filtrerades vid 0 - 50 Hz. En successiv ökning av luktämne koncentration ledde till en större och snabbare respons, som också avslutas långsammare när luktämne exponering avslutades.
Örns kan visa en oscillerande svarsmönster under långa stimuli vid mellanliggande odorant koncentrationer (Fig. 4B). Här en acetephenone (3 M) svarar ORN stimulerades under 8 sekunder. Efter en snabb och övergående maximal känslighet vid början av stimuleringen ett antal mindre, återkommande svar observeras. Inspelningen bandbredd var 0 till 50 Hz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH DC009613, Human Frontiers Science Program och Morley Care Fellowship (till JR).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
