Summary
Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) convertir les signaux d'odeurs dans un premier récepteur de courant qui à son tour déclenche des potentiels d'action qui sont acheminés à des neurones de second ordre dans le bulbe olfactif. Ici, nous décrivons la technique pipette d'aspiration d'enregistrer simultanément le récepteur olfactif courant induit et des potentiels d'action de ORNs souris.
Abstract
Animaux échantillonner l'environnement odorant autour d'eux à travers les systèmes chimiorécepteurs situés dans la cavité nasale. Signaux chimiosensoriels affectent les comportements complexes tels que le choix des aliments, prédateur, conspécifiques et la reconnaissance compagnon et d'autres indices socialement pertinents. Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) sont situés dans la partie dorsale de la cavité nasale noyée dans l'épithélium olfactif. Ces neurones bipolaires envoyer un axone vers le bulbe olfactif (voir Fig. 1, Reisert & Zhao 1, initialement publié dans le Journal of General Physiology) et d'étendre une dendrite unique à la frontière épithéliales de rayonner cils où dans le mucus qui recouvre la olfactif épithélium. Les cils contenir le mécanisme de transduction du signal qui mène à excitateurs afflux de courant à travers les canaux de transduction ciliaire, un nucléotide cyclique-dépendant (CNG) et un canal de Ca 2 +-Cl actif - canal (Fig. 1). Le depola qui a suivirisation déclenche la génération du potentiel d'action sur le corps 2-4 Cellules.
Dans cette vidéo, nous décrivons l'utilisation de la "technique d'aspiration pipette" pour enregistrer odorant réponses induites à partir ORNs. Cette méthode a été développée à l'origine pour enregistrer à partir photorécepteurs à bâtonnets 5 et une variante de cette méthode peut être trouvé à jove.com modifié pour enregistrer à partir de cônes photorécepteurs de souris 6. La technique pipette d'aspiration a été adapté plus tard pour également enregistrer à partir ORNs 7,8. Brièvement, après dissociation de l'épithélium olfactif et d'isolement des cellules, le corps de la cellule entière d'une ORN est aspiré dans la pointe de la pipette d'enregistrement. La dendrite et les cils restent exposées à la solution de bain et donc accessible à des changements de solution pour permettre par exemple odorant ou une application de blocage pharmacologique. Dans cette configuration, pas d'accès à l'environnement intracellulaire est acquise (pas de blocage de tension de cellule entière) et la tension intracellulaire reste libre de varier. Tout celaux l'enregistrement simultané du courant qui provient du récepteur lent à des cils et des potentiels d'action rapide tiré par le corps 9 cellules. La différence de cinétique entre ces deux signaux permet de les séparer en utilisant différents paramètres de filtre. Cette technique peut être utilisée sur n'importe quel type sauvage ou de la souris knock-out ou d'enregistrer de manière sélective à partir ORNs qui expriment la GFP également d'étiqueter des sous-ensembles spécifiques de ORNs, par exemple, l'expression d'un récepteur olfactif donnée ou canal ionique.
Protocol
1. La Recording Setup
La chambre d'enregistrement est montée sur un microscope inversé Nikon Eclipse TE2000U avec optique à contraste de phase qui est monté sur une table pneumatique et électrique blindé avec une cage de Faraday. La chambre d'enregistrement Plexiglas compose de deux sections partiellement séparés par une barrière et collé sur une lame de verre silanisée. Une section de la chambre est utilisée pour régler les cellules tandis que l'autre est utilisé pour stimuler l'exposition pendant l'enregistrement afin de minimiser l'exposition prématurée du règlement, mais encore que les cellules inutilisées odorant. La configuration d'enregistrement se compose d'une pipette d'aspiration (voir ci-dessous) monté dans un porte-pipette culot et une électrode de masse. La pipette d'aspiration est positionnée à l'aide d'un micromanipulateur. Solutions de stimulation sont appliquées au moyen d'un tube à triple cylindre en verre carré, avec chaque tube carré étant de 0,7 mm x 0,7 mm. Le verre à triple canon est relié à un système de perfusion rapide étape motorisé monté sur un manipulateur (SUTter SF-77B, Warner Instruments) et entré dans la chambre d'enregistrement à un angle d'environ 45 °. L'extrémité de la vitre triple canon est biseautée à un angle de 45 ° à nouveau de telle sorte que la face finale (ouverture) de la vitre à triple canon est vertical pour permettre le positionnement à proximité de la pipette.
La pipette d'aspiration d'électrode remplie d'une solution de Ringer-type de mammifère et l'électrode de masse sont reliées à la headstage 1 GΩ d'un amplificateur de patch-clamp (CP-501A, Warner Instruments) en mode de verrouillage de tension. Le signal analogique provenant de l'amplificateur (filtre passe-bas à 5 kHz) est affichée sur un oscilloscope numérique pour contrôler le signal en temps réel et également relié à un filtre de Bessel 8-pôle (Krohn-Hite) lorsque le signal est filtré passe-bas à 50 Hz. Les deux signaux (filtrage passe-bas à 5 kHz et 50 Hz) sont introduits dans un convertisseur A / D (Cambridge Electronic Design Micro 1401 MKII) qui est connecté à un ordinateur pour l'acquisition des données. Les données sont enregistrées à l'aide du signal 3 acquisition logiciel (Cambridge Electronic Design) à une fréquence d'échantillonnage de 10 kHz. Le signal est enregistré sur les deux bandes passantes différentes d'abord enregistrer le récepteur en cours ainsi que les potentiels d'action superposés, puis le récepteur seul courant (voir Fig. 2). Le système de perfusion est utilisé pour commuter rapidement entre Ringer (témoin) et des stimuli olfactifs solution ou une solution de la composition désirée et est commandé par le signal PC et logiciel 3. Les solutions sont contenues dans des seringues 60 ml et le débit est contrôlé par qualité médicale régulateurs de débit intraveineux. Typiquement, le débit est réglé à 1 ml / min.
L'aspiration de la pipette d'enregistrement est commandé de la manière suivante: Le port du côté du porte-pipette est reliée à une conduite d'huile qui à son tour est reliée à un réservoir d'huile à hauteur réglable. Élever ou abaisser le réservoir assure que la pression d'écoulement et, par conséquent pipette Ringer à travers la pointe de la pipette est minime et légèrement positif. Aspiration supplémentaire ou de pression peut être appliquée à travers un tube relié à l'espace aérien du réservoir avec une embouchure à l'autre extrémité pour aspirer le corps de la cellule d'une ORN isolé dans la pointe de la pipette d'enregistrement.
Les expériences sont réalisées à 37 ° C afin de mieux simuler l'état natif physiologique de la cellule. La température est contrôlée en faisant passer les solutions à travers une unité de chauffage sur mesure qui consiste en des résistances en céramique à travers lequel les tubes en acier inoxydable contenant les solutions sont adoptées 10. La température est contrôlée au moyen d'un thermomètre à thermocouple (Fluke).
2. Solutions
Ringer mammifères solution de (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0,01 EDTA, HEPES 10, 10 glucose. Le pH a été ajusté à 7,5 avec NaOH. A 10% d'une solution de Ringer diluée a été utilisé pour mesurer le courant de jonction. Odorasolutions tdp: acétophénone et l'eugénol ont été préparés quotidiennement dans la solution de Ringer à partir de 20 actions DMSO mM.
3. Faire électrodes
- Placez un verre borosilicate unfilamented capillaire dans une Sutter P-97 extracteur micropipette et tirez une micropipette avec un cône long.
- Transférer la pipette à un support micropipette sur mesure monté sur un microscope Nikon Eclipse E200 qui est à son tour muni d'un réticule dans l'oculaire et un couteau mobile diamant monté sur la scène.
- Observez la pointe de la pipette sous l'objectif 20x et en utilisant le réticule comme un guide; scribe doucement la pipette à un angle de 90 ° à l'aide du couteau en diamant sur mesure où la pipette est de 10 um de large (diamètre extérieur).
- Déplacez le couteau diamant de plus vers la pointe et appliquer graduellement la pression sur la pointe du couteau de diamant. La pointe de la pipette doit rompre proprement à l'endroit où il a été prescrit.
Sinon les étapes 3.1 à3.4 peuvent être combinés et pipettes peut être tiré avec des dimensions souhaitées directement sans avoir à couper la pointe de la pipette, mais il peut s'avérer plus difficile de tirer de manière fiable pipettes avec un tel diamètre de l'extrémité large et les bords coupés proprement.
- Sous un objectif 40X, feu polir l'extrémité de la pipette à un diamètre intérieur de 5 um à l'aide d'un filament chauffé électriquement. Une fois terminée, la micropipette est prêt à être utilisé pour l'enregistrement des courants de ORNs souris. La résistance ouverte pipette devrait être d'environ 1 MW lorsqu'il est rempli de Ringer.
4. Isolement des neurones récepteurs olfactifs
- Sacrifiez une souris en suivant les directives et règlements institutionnels. Retirer la tête, décoller la peau recouvrant le crâne et en dedans coupent la tête le long de la ligne médiane.
- Placez les deux hémi-tête sous un stéréomicroscope à dissection, retirer la cloison nasale et enlever les cornets olfactifs. Placez tous les tissus dans une boîte de Pétri avec du glucose contenant solution de Ringer mammifères.
- Peler l'épithélium olfactif hors du cartilage sous-jacent à partir de deux cornets et transférer le tissu dans un tube Eppendorf contenant 250 ul Ringer. Nous utilisons des tissus de 2 cornets pour obtenir la bonne densité de cellules pour la taille de notre chambre d'enregistrement. Stocker le tissu restant à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Vortexer le tube Eppendorf contenant l'épithélium olfactif brièvement deux fois pendant 1 s à vitesse moyenne. Cette étape conduit à la dissociation mécanique des ORNs de l'épithélium.
- Placez la solution de Ringer contenant les ORNs dissociés dans la chambre d'enregistrement. Retirer les gros morceaux de tissu également présentes dans la suspension à l'aide de pinces fines.
- Laissez les ORNs se contenter de 20 minutes avant le début de surfusion continue avec avis de sonnerie et de procéder à des enregistrements.
5. Enregistrements
- Abaisser l'électrode d'aspiration reliée à la conduite d'huile dans la chambre d'enregistrement et regulmangé la hauteur du réservoir d'huile à établir une pression légèrement positive à la pointe de la pipette. Cela peut être fait en observant les débris cellulaires par exemple s'éloigner de (pression positive) ou vers (pression négative) de la pipette. Essayez de ne pas contaminer la pointe de la pipette avec les débris cellulaires.
- Numérisez la chambre d'enregistrement pour une ORN isolée qui peut être reconnu par sa morphologie bipolaire typique utilisant un grossissement de 20-40x. Déplacer l'électrode d'enregistrement à proximité immédiate du corps cellulaire ORN. Commencer à sucer doucement de sorte que le corps de la cellule entre dans la pointe de la pipette. Lentement et continuer à appliquer le vide jusqu'à ce que le corps de la cellule entière est aspiré dans la pointe de la pipette d'aspiration, laissant la dendrite et les cils exposée à la solution de bain. Pour les images de ORNs aspirés et les formes de pipettes voir 7,11. Pas de garantir qu'une fois l'aspiration est appliquée, l'ORN ne se déplace pas dans ou hors de la pipette. Si c'est le cas, régler la hauteur du réservoir d'huile en conséquence.
- Utilisation de l'micromanipulateurs, déplacer la pipette d'aspiration de la section contenant les ORNs réglées à la section d'enregistrement de la chambre. Placer soigneusement la pipette d'aspiration en face du tube 3-coups pour un échange de solution. La pipette d'aspiration doit être placé suffisamment près de l'ouverture du tube 3-coups de telle sorte que l'ORN est exposé à un écoulement laminaire évitant ainsi la turbulence de mélange et de réaliser l'échange rapide solution. La solution d'échange est réalisé par le renforcement de l'interface entre les flux parallèles de solution s'écoulant à travers la pointe de la pipette d'aspiration. L'évolution dans le temps de l'échange solution est généralement autour de 20 ms, mesurée à partir du courant de jonction évoquée par le renforcement de la cellule entre les solutions de composition ionique différente (voir Fig. 2). Solutions sont livrées par gravité.
6. Les résultats représentatifs
Figure 1. A neurones récepteurs bipolaires) dans le bulbe olfactif. B) Les machines transduction du signal dans les franges conduit finalement à excitateurs afflux actuel. La dépolarisation qui a suivi déclenche la génération du potentiel d'action au niveau du corps cellulaire.
La figure 2 montre la vitesse et la fiabilité de l'échange solution. Une pipette a été renforcée à la normale dans Ringer diluée à 10% pendant 100 ms, et le courant de jonction résultant de la concentration en ions différente a été enregistré. Noir est la trace average de 5 essais, rouge retracer son SD. Le peu de changement en SD lors de l'échange solution démontre la fiabilité de l'échange solution d'un essai à et l'absence de bruit en excès dans le flux de solution non plus.
La figure 3 montre une réponse eugénol induite à partir d'une ORN utilisant la technique pipette d'aspiration. L'ORN a été exposé à 100 pM pour l'eugénol 1 seconde, comme indiqué par la barre au-dessus de l'enregistrement. Dans la Fig. 3A (trace noire) du courant du récepteur a été filtré à une bande passante 0 - 50 Hz pour afficher uniquement le récepteur de courant Fig.. La figure 3B montre le même enregistrement, désormais filtré à la large bande passante de 0 - 5000 Hz (rouge trace) pour afficher également des potentiels d'action (PA, indiqué par des flèches). L'encart montre la même trace dans un délai étendu de visualiser plus clairement les points d'accès à l'apparition de la réponse.
Famille Figure 4. Dose-réponse d'une ORN eugénol sensible (A). L'eugénol est utilisé à des concentrations allant de 0,3 um à 100 um, la durée du stimulus était de 1 s et des traces ont été filtrés à 0 - 50 Hz. Une augmentation progressive de la concentration odorante conduit à une réponse plus large et plus rapide, qui a également mis fin à plus lentement après l'exposition odorant a été résilié.
ORNs peut afficher un profil de réponse oscillatoire durant de longues stimulations odorantes à des concentrations intermédiaires (Fig. 4B). Voici un acetephenone (3 uM) ORN réactif a été stimulée pendant 8 secondes. Après une réponse rapide et transitoire de crête au début de la stimulation d'une série de petites réponses récurrents sont observés. La bande passante d'enregistrement était de 0 - 50 Hz.
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Discussion
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH DC009613, le Programme des sciences humaines frontières et Morley soins de bourse (JR).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
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- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A.
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