Summary
Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) zu konvertieren Geruchs-Signale zunächst in einem Rezeptor Strom, wiederum löst Aktionspotentiale, die bis zur zweiten Ordnung Neuronen im Riechkolben gefördert werden. Hier beschreiben wir die Saugpipette Technik gleichzeitig aufzeichnen Duftstoff-induzierte Rezeptor-Strom-und Aktionspotentiale aus Maus ORN.
Abstract
Tiere probieren Sie die Geruchsstoffe Umwelt um sie herum durch die chemosensorischen Systemen in der Nasenhöhle befindet. Chemosensorische Signale beeinflussen komplexe Verhaltensweisen wie die Wahl der Lebensmittel, Raubtier, Artgenossen und Mate Anerkennung und anderen gesellschaftlich relevanten Hinweisen. Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) im dorsalen Teil der Nasenhöhle im olfaktorischen Epithel eingebettet. Diese bipolare Nervenzellen senden Sie eine Axon zum Riechkolben (siehe Abb. 1, Reisert & Zhao 1, ursprünglich im Journal of General Physiology veröffentlicht) und Erweiterung eines einzigen Dendriten der epithelialen Grenze, von wo aus Zilien strahlt in den Schleim, der die olfaktorische deckt Epithel. Die Flimmerhärchen enthalten die Signaltransduktion Maschinen, die letztlich zu aktuellen Einstrom durch den ciliary Transduktion Kanälen, zyklisch Nukleotid-gesteuerten (CNG)-Kanal und einem Ca 2 +-aktivierten Cl exzitatorischen - Kanal (Abb. 1). Die anschließende depolarization löst Aktionspotential Generation am Zellkörper 2-4.
In diesem Video beschreiben wir die Verwendung des "Saugpipette Technik", um Duftstoff-induzierten Reaktionen von ORN aufnehmen. Diese Methode wurde ursprünglich entwickelt, um aus Stäbchen-Photorezeptoren 5 aufnehmen und eine Variante dieser Methode können jove.com modifiziert, um von der Maus Zapfen-Photorezeptoren 6 aufzeichnen gefunden werden. Die Saugpipette Technik wurde später auch angepasst ist, um aus 7,8 ORN aufzuzeichnen. Kurz nach der Dissoziation des olfaktorischen Epithel und Zellisolation wird die gesamte Zelle Körper eines ORN in die Spitze einer Pipette angesaugt Aufzeichnung. Die Dendriten und die Zilien frei bleiben der Badlösung und somit zugänglich Lösung Änderungen an zB Geruchsstoff oder pharmakologische Blocker-Anwendung zu ermöglichen. In dieser Konfiguration wird kein Zugriff auf die intrazelluläre Umgebung gewonnen (kein Ganzzell-Spannungsklammer) und die intrazelluläre Spannung bleibt frei zu variieren. Dies allesverdankt die gleichzeitige Aufnahme der langsamen Rezeptor-Strom, der an der Zilien und schnelles Handeln Potenziale durch den Zellkörper 9 abgefeuert stammt. Der Unterschied in der Kinetik zwischen diesen beiden Signalen ermöglicht ihnen getrennt mit verschiedenen Filtereinstellungen werden. Diese Technik kann auf jedem Wildtyp oder Knockout-Maus verwendet werden oder selektiv aufzuzeichnen aus ORN, die GFP exprimieren auch an spezifische Teilmengen von ORN kennzeichnen, z. B. die Expression eines bestimmten Rezeptors oder Geruchsstoff Ionenkanal.
Protocol
Ein. Die Recording Setup
Aufzeichnungsverfahren Kammer auf einem Nikon Eclipse-TE2000U Inversmikroskop mit Phasenkontrast Optik, die auf einer Luft Tisch ausgestattet ist und elektrisch abgeschirmten Verwendung einer Faraday-Käfig angebracht. Die Plexiglas Aufnahme Kammer besteht aus zwei Abschnitten teilweise durch eine Barriere getrennt und klebte auf einem silanisierten Glasobjektträger. Ein Abschnitt der Kammer verwendet wird, um die Zellen absetzen, während der andere für Stimulus-Exposition während der Aufzeichnung verwendet werden, um ein vorzeitiges ständiger Belichtung, aber noch nicht verwendeten Zellen Odorans zu minimieren. Die Aufnahme-Setup besteht aus einer Saugpipette (siehe unten) in einem pelletierten Pipettenhalter und einer Masseelektrode montiert. Die Saugpipette positioniert ist mit einem Mikromanipulator. Stimulus-Lösungen werden unter Verwendung einer Triple-Barrel Glas Vierkantrohr, mit jedem Vierkantrohr von 0,7 mm x 0,7 mm. Die Triple-Barrel Glas wurde mit einer motorisierten schnell Schritt Perfusionssystem auf einem Manipulator montiert (Sut verbundenter SF-77B, Warner Instruments) und in die Aufnahmekammer unter einem Winkel von ca. 45 °. Das Ende des Zylinders Dreifach Glas wurde in einem Winkel von 45 ° wieder derart, dass die endgültige Fläche (Öffnung) des dreifach Barrel Glas vertikal zu enge Positionierung der Pipette war ermöglichen abgeschrägt.
Die Saugpipette Elektrode mit Standard Säuger Ringerlösung und der Masseelektrode gefüllt werden dem 1 G Headstage eines Patch-Clamp Verstärkers (PC-501A, Warner Instruments) in Spannungsklammer Modus verbunden ist. Das analoge Signal von dem Verstärker (Tiefpass bei 5 kHz gefiltert) auf einem digitalen Oszilloskop dargestellt, um das Signal in Echtzeit zu überwachen und auch auf einen 8-Pol-Bessel-Filter (Krohn-Hite), wo das Signal tiefpassgefiltert verbunden bei 50 Hz liegt. Beide Signale (Tiefpass bei 5 kHz und 50 Hz gefiltert) werden in einem A / D-Wandler (Cambridge 1401 Electronic Design Micro mkII), die an einen PC zur Datenerfassung verbunden eingespeist. Die Daten werden aufgezeichnet mit Signal 3 acquisition Software (Cambridge Electronic Design) bei einer Abtastfrequenz von 10 kHz. Das Signal wird an den beiden unterschiedlichen Bandbreiten aufzuzeichnenden ersten Aufzeichnung der Rezeptor zusammen mit den aktuellen überlagert Aktionspotentialen und dann den Rezeptor aktuellen allein (s. Abb.. 2). Die Perfusion wird verwendet, um schnell zwischen Ringer (Steuer)-Lösung und Riechstoff Reize oder einer Lösung der gewünschten Zusammensetzung und wird von der PC-und Signal 3 Software gesteuert. Die Lösungen werden in 60 ml Spritzen enthielten und der Durchfluss wird durch medizinischem intravenöse Fließreguliermitteln gesteuert. Typischerweise wird die Flussrate 1 ml / min eingestellt.
Der Sog auf dem Aufzeichnungsmaterial Pipette wird in der folgenden Weise gesteuert wird: Die Seitenöffnung der Pipettenhalter an eine Ölleitung, die wiederum mit einer höhenverstellbaren Ölreservoir verbunden ist. Anheben oder Absenken des Behälters stellt sicher, dass die Pipette Druck und damit Ringer Strömung durch die Spitze des pipette ist minimal und leicht positiv. Zusätzliche Saug-oder Druck kann durch ein Rohr verbunden ist, um den Luftraum des Behälters mit einem Mundstück an dem anderen Ende an den Zellkörper eines isolierten ORN in die Spitze der Pipette zu saugen Aufzeichnung angewandt werden.
Die Versuche werden bei 37 ° C, um genau simuliert die native physiologischen Zustand der Zelle. Die Temperatur wird durch Leiten der Lösung durch eine maßgeschneiderte Heizeinheit, die aus Keramik, durch den Widerständen Edelstahlrohre mit den Lösungen 10 geführt sind, besteht gesteuert. Die Temperatur wird mit Hilfe eines Thermoelement-Thermometer (Fluke).
2. Lösungen
Säuger-Ringer-Lösung (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 Glucose. Der pH wurde mit NaOH auf 7,5 eingestellt. Eine 10% ige verdünnte Ringerlösung wurde zur Messung der Verbindungspunkt Strom. Odorant-Lösungen: Acetophenon und Eugenol wurden täglich in Ringer-Lösung von 20 mM DMSO Aktien vorbereitet.
3. Herstellung Elektroden
- Legen Sie eine unfilamented Borosilikatglas Kapillare in einer Sutter P-97 Feinpipettenziehvorrichtung und ziehen eine Mikropipette mit einer langen Kegel.
- Übertragen der Pipette ein maßgeschneidertes Mikropipette Halter auf einem Nikon Eclipse-E200 Mikroskop, das wiederum mit einem Retikel im Okular und einem beweglichen Diamantmesser auf der Bühne montiert ist eingepasst befestigt.
- Beachten Sie die Spitze der Pipette unter dem 20x-Objektiv und mit dem Fadenkreuz als Orientierungshilfe; sanft Schreiber die Pipette in einem 90 Grad-Winkel mit den maßgeschneiderten Diamantmesser, wo die Pipette ist 10 um breit (Außendurchmesser).
- Bewegen Sie die Diamantmesser weiter in Richtung der Spitze und allmählich Druck auf die Spitze mit dem Diamant-Messer. Die Pipettenspitze sollte sauber brechen an der Stelle, wo es beschrieben.
Alternativ Schritte 3,1 bis3,4 kombiniert werden können und Pipetten können mit den gewünschten Abmessungen direkt, ohne die Pipettenspitze geschnitten gezogen werden, obwohl es nachweisen kann, härteren zuverlässig Pipetten mit einer so großen Durchmesser der Spitze und saubere Schnittkanten zu ziehen.
- Unter einem 40x-Objektiv, feuern polieren die Spitze der Pipette zu einer inneren Durchmesser von 5 um unter Verwendung eines elektrisch beheizten Filament. Sobald Sie fertig sind, ist die Mikropipette bereit für die Aufnahme Ströme von Maus ORN verwendet werden. Die offene Pipette Widerstand sollte etwa 1 MOhm sein, wenn mit Ringerlösung gefüllt.
4. Isolation der olfaktorischen Rezeptor-Neuronen
- Opfere eine Maus nach institutionellen Richtlinien und Vorschriften. Entfernen Sie den Kopf, Schale weg die Haut über den Schädel und medial halbieren den Kopf entlang der Mittellinie.
- Legen Sie die zwei hemi-Köpfe unter einem Seziertisch Stereomikroskop, ziehen Sie die Nasenscheidewand und entfernen Sie die olfaktorischen Nasenmuscheln. Zeigen alle Gewebe in einer Petrischale mit Glukose containing Säugetieren Ringer-Lösung.
- Peel olfaktorischen Epithel dem darunterliegenden Knorpel aus zwei Nasenmuscheln und übertragen das Gewebe in ein Eppendorf-Röhrchen mit 250 ul Ringer. Wir verwenden Gewebes von 2 Nasenmuschel um die gewünschte Dichte der Zellen für die Größe der Aufnahme Kammer zu erhalten. Speicherung des verbleibenden Gewebes bei 4 ° C für die spätere Verwendung.
- Vortex der Eppendorf-Röhrchen mit dem olfaktorischen Epithel zweimal kurz für 1 Sek. bei mittlerer Geschwindigkeit. Dieser Schritt führt zu mechanischen Dissoziation der ORN vom Epithel.
- Legen Sie die Ringer Lösung, welche die dissoziierten ORN in der Aufnahme Kammer. Entfernen große Gewebestücke auch in der Suspension mit feinen Pinzetten.
- Lassen Sie die ORN für 20 Minuten absetzen, bevor kontinuierliche Superfusion mit Ringer und fahren Sie mit den Aufnahmen.
5. Recordings
- Absenken des Saug-Elektrode mit der Ölleitung in die Aufnahmekammer und regulaß die Höhe des Ölreservoirs bis leicht positiven Druck an der Pipettenspitze zu etablieren. Dies kann zB durch Beobachten Zelltrümmer weg von (Überdruck) oder in Richtung (Unterdruck) der Pipette erfolgen. Versuchen Sie nicht, um die Spitze der Pipette mit Zelltrümmern verunreinigen.
- Scannen des Ableitkammer für ein isoliertes ORN die durch ihre typische Morphologie unter Verwendung eines bipolaren Vergrößerung von 20-40x erkannt werden kann. Bewegen der Aufnahme-Elektrode in der Nähe des ORN Zellkörper. Sanft gestartet saugen, so daß die Zellkörper in die Spitze der Pipette eintritt. Vorsichtig und langsam weiter Saug gelten, bis die gesamte Zellkörper in die Spitze der Saugpipette gezogen wird, so dass die Dendrit und Zilien ausgesetzten der Badlösung. Für Bilder der angesaugten ORN und Pipette Formen 7,11. Stellen Sie sicher, dass, sobald kein Sog angewendet wird, die ORN bewegt sich nicht in die oder aus der Pipette. Wenn ja, Einstellen der Höhe des Ölreservoirs entsprechend.
- Mit denMikromanipulatoren, bewegen die Saugpipette aus dem Abschnitt enthaltend die abgewickelt ORN zu dem Aufzeichnungsabschnitt der Kammer. Legen Sie das Saugpipette vor der 3-barreled Röhre Lösung Austausch. Die Saugpipette sollte so nah an der Öffnung des Rohres 3-tonneliert werden, so dass die ORN zu einer laminaren Strömung wodurch Mischen Turbulenz ausgesetzt ist und eine schnelle Lösung Austausch zu erreichen. Die Lösung Austausch wird durch Abstufung der Grenzfläche zwischen parallelen Strömen von strömenden Lösung über die Spitze der Saugpipette erreicht. Der zeitliche Verlauf der Lösung Austausch ist typischerweise etwa 20 ms, von der Kreuzung durch Abstufung der aktuellen Zelle zwischen Lösungen unterschiedlicher Ionenzusammensetzung (siehe Abb. 2). Evozierten gemessen. Lösungen werden durch die Schwerkraft geliefert.
6. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. A) Bipolar-Rezeptor Neuronen im Riechkolben. B) Signaltransduktion Maschinen in der Zilien führt letztendlich zu aktuellen Zustrom exzitatorischen. Die daraus resultierende Depolarisation auslöst Aktionspotential Generation an der Zellkörper.
Abbildung 2 zeigt die Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit der Lösung Austausch. Eine Pipette wurde von der normalen in 10% verwässert Ringer für 100 ms und die Verbindungsstelle resultierende Strom aus der unterschiedlichen Ionen-Konzentration aufgezeichnet wurde intensiviert. Schwarze Kurve ist die aveWut von 5 Studien verfolgen rote ihre SD. Der kleine Änderung in SD während der Lösung Austausch zeigt die Zuverlässigkeit der Lösung Austausch von Versuch zu Versuch und das Fehlen von übermäßigem Rauschen entweder in Lösung Stream.
Abbildung 3 zeigt eine Eugenol-induzierten Antwort von einem ORN Verwendung der Saugpipette Technik. Die ORN wurde auf 100 uM Eugenol für 1 Sekunde ausgesetzt, wie durch den Balken oberhalb der Aufnahme angezeigt. In Abb. 3A (schwarze Kurve) der Rezeptor Strom wurde bei einer Bandbreite gefiltert 0 - 50 Hz, um nur die Rezeptorstrom Abb.. 3B zeigt die gleiche Aufnahme, jetzt bei der großen Bandbreite von 0 gefiltert - 5000 Hz (rote Kurve) auch angezeigt Aktionspotentiale (APs, durch Pfeile angedeutet). Der Einschub zeigt das gleiche Spur auf einer Zeitskala erweitert zu APs deutlicher sichtbar zu Beginn der Reaktion.
Abbildung 4. Dosis-Wirkungs-Familie eines Eugenol ansprechenden ORN (A). Eugenol in Konzentrationen im Bereich von 0,3 um bis 100 um verwendet wurde, war die Reizdauer 1 s und Spuren wurden bei 0 filtriert - 50 Hz liegt. Eine schrittweise Erhöhung Odormittelkonzentration führte zu einer größeren und schnelleren Reaktion, die auch beendet langsamer einmal Odorans Belichtung beendet wurde.
ORN kann das Schwingungsverhalten Muster während langer Stimulationen an Zwischenpositionen Geruchsstoffkonzentrationen (4B) anzuzeigen. Hier ein acetephenone (3 uM), die ORN wurde für 8 Sekunden stimuliert. Nach einer schnellen und transienten Spitzenempfindlichkeit zu Beginn der Stimulation einer Reihe kleinerer, sich wiederholenden Reaktionen beobachtet. Die Aufnahme Bandbreite betrug 0 - 50 Hz.
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Discussion
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH DC009613, dem Human Frontier Science Program und Morley Pflege Fellowship (JR) unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A.
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
