Summary
Neuroni recettori olfattivi (ORNs) convertire i segnali olfattivi prima in un recettore corrente che a sua volta attiva i potenziali d'azione che vengono trasmessi ai neuroni di secondo ordine nel bulbo olfattivo. Qui si descrive la tecnica pipetta di aspirazione di registrare simultaneamente l'odorizzante indotta recettore correnti e potenziali d'azione da ORNs mouse.
Abstract
Animali campionare l'ambiente intorno odorosa attraverso i sistemi chemiosensoriali situati nella cavità nasale. Segnali chemiosensoriali influenzare comportamenti complessi come la scelta degli alimenti, predatore, conspecifici e il riconoscimento mate e altri segnali socialmente rilevanti. Neuroni recettori olfattivi (ORNs) sono situati nella parte dorsale della cavità nasale incorporato nell'epitelio olfattivo. Questi neuroni bipolari inviare un assone al bulbo olfattivo (vedi fig. 1, Reisert & Zhao 1, originariamente pubblicato nella Gazzetta di Fisiologia Generale) e di estendere un singolo dendrite al confine epiteliale da cui si irradiano le cilia nel muco che copre l'olfatto epitelio. Le ciglia contiene il macchinario di trasduzione del segnale che porta infine al eccitatori afflusso di corrente attraverso i canali di trasduzione ciliari, un ciclico nucleotide-gated (CNG) e un canale Ca 2 +-attivata Cl - canale (Fig. 1). Il depola conseguenterizzazione innesca generazione potenziale d'azione al corpo cellulare 2-4.
In questo video si descrive l'uso della "tecnica di aspirazione pipetta" per registrare odorizzante risposte indotte da ORNs. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per registrare da bastoncelli 5 e una variante di questo metodo può essere trovato alla jove.com modificato per registrare da fotorecettori cono del mouse 6. La tecnica pipetta di aspirazione è stato in seguito adattato per registrare anche da ORNs 7,8. Brevemente, dopo dissociazione dell'epitelio olfattivo e isolamento cellulare, il corpo intera cella di un ORN viene aspirato nella punta di una pipetta di registrazione. Il dendrite e le ciglia rimangono esposti alla soluzione del bagno e quindi accessibili a soluzione cambia per abilitare odorizzante es o applicazione bloccante farmacologica. In questa configurazione, nessun accesso all'ambiente intracellulare viene acquisita (non whole-cell voltage clamp) e la tensione intracellulare rimane libero di variare. Tutto questodeve il la registrazione simultanea della corrente recettore lento che ha origine alla ciglia e potenziali d'azione veloci generati dal corpo cellulare 9. La differenza nella cinetica tra questi due segnali permette loro di essere separati mediante diverse impostazioni di filtro. Questa tecnica può essere utilizzato su qualsiasi tipo selvaggio o di topo knockout o per registrare selettivamente da ORNs anche che esprimono GFP etichettare specifici sottoinsiemi di ORNs, ad esempio esprimere un recettore olfattivo dato o canale ionico.
Protocol
1. Il programma di installazione di registrazione
La camera di registrazione è montata su un microscopio invertito Nikon TE2000U Eclipse con ottica di contrasto di fase che è montato su un tavolo aria e schermati elettricamente usando una gabbia di Faraday. La camera di registrazione Plexiglass consiste di due sezioni parzialmente separate da una barriera e incollato su un vetrino silanizzato. Una sezione della camera è utilizzato per regolare le cellule, mentre l'altro viene utilizzato per stimolo-esposizione durante la registrazione per ridurre al minimo l'esposizione prematura di una consolidata ma ancora non utilizzate cellule odorizzante. La configurazione di registrazione consiste di una pipetta di aspirazione (vedi sotto) montato su un supporto pipetta pellettato e un elettrodo di massa. La pipetta di aspirazione è posizionato utilizzando un micromanipolatore. Le soluzioni stimolo vengono applicati usando una tripla canna tubo quadrato di vetro, con ogni tubo quadrato essendo 0,7 millimetri x 0,7 mm. Il triplo cilindro in vetro è stato collegato ad un motore passo-veloce sistema di perfusione montato su un manipolatore (Sutter SF-77B, Warner Instruments) ed entra in camera di registrazione ad un angolo di ~ 45 °. La fine della canna triplo vetro è smussata ad un angolo di 45 ° ancora tale che la faccia finale (apertura) del triplo cilindro in vetro era verticale per consentire il posizionamento stretta della pipetta.
L'elettrodo pipetta di aspirazione riempito con soluzione standard di Ringer mammiferi e l'elettrodo di massa sono collegati al headstage 1 GΩ di un amplificatore patch clamp (PC-501A, Warner Instruments) in modalità voltage clamp. Il segnale analogico proveniente dall'amplificatore (filtro passa basso a 5 kHz) viene visualizzato su un oscilloscopio digitale per monitorare il segnale in tempo reale ed è anche collegato ad un 8 poli del filtro di Bessel (Krohn-Hite) dove il segnale è basso filtro passa a 50 Hz. Entrambi i segnali (filtro passa basso a 5 kHz e 50 Hz) sono alimentati in un convertitore A / D (Cambridge Electronic Design Micro mkII 1401) che è collegato ad un PC per l'acquisizione dati. I dati vengono registrati tramite segnale 3 ACQuisition software (Cambridge Electronic Design) ad una frequenza di campionamento di 10 kHz. Il segnale viene registrato in due diverse ampiezze di banda prima di registrare il recettore corrente unitamente ai potenziali di azione sovrapposti e quindi il recettore corrente solo (vedere Fig. 2). Il sistema di perfusione viene utilizzato per commutare rapidamente tra Ringer (controllo) e soluzione di stimoli olfattivi o qualsiasi soluzione di composizione desiderata ed è controllato dal PC e Signal 3 software. Le soluzioni sono contenuti in 60 ml siringhe e la portata viene controllata da medicale regolatori di flusso per via endovenosa. Tipicamente, la portata viene impostato a 1 ml / min.
L'aspirazione sul pipetta registrazione viene controllato nel modo seguente: La porta lato del supporto pipetta è collegato ad una linea di olio che a sua volta è collegato ad una altezza regolabile serbatoio dell'olio. Alzando o abbassando il serbatoio assicura che la pressione pipetta e quindi il flusso Ringer attraverso la punta del pipette è minima e leggermente positivo. Aspirazione supplementare o pressione può essere applicato attraverso un tubo collegato allo spazio aereo del serbatoio con un bocchino all'altra estremità di succhiare il corpo cellulare di un ORN isolato nella punta della pipetta registrazione.
Gli esperimenti vengono eseguiti a 37 ° C per simulare la condizione nativa strettamente fisiologico della cellula. La temperatura è controllata passando le soluzioni attraverso una misura unità di riscaldamento che consiste di resistori ceramici che sono passati attraverso tubi in acciaio inox contenenti le soluzioni 10. La temperatura è controllata mediante un termometro a termocoppia (Fluke).
2. Soluzioni
Ringer soluzione di mammifero (mM): 140 NaCl, KCl 5, 1 MgCl2, 2 CaCl 2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 glucosio. Il pH è stato regolato a 7,5 con NaOH. A 10% diluita Ringer soluzione è stata usata per misurare la corrente di giunzione. Odorasoluzioni nt: Acetofenone e eugenolo sono stati preparati tutti i giorni in soluzione di Ringer dalle scorte mm 20 DMSO.
3. Fare Elettrodi
- Inserire un vetro borosilicato unfilamented capillare in un P-97 Sutter estrattore micropipetta e tirare una micropipetta con un cono lungo.
- Trasferire la pipetta con una misura titolare micropipetta montato su un microscopio Nikon Eclipse E200 che è a sua volta dotato di un reticolo nell'oculare e un coltello mobile diamante montato sulla scena.
- Osservare la punta della pipetta all'obiettivo 20x e utilizzando il reticolo come guida; delicatamente scrivano la pipetta a 90 ° con la misura in cui il coltello di diamante pipetta è di 10 micron di larghezza (diametro esterno).
- Spostare il coltello di diamante più verso la punta e applicare gradualmente la pressione sulla punta con il coltello di diamante. La punta della pipetta deve rompere in modo pulito al punto in cui è stato descritto esso.
In alternativa, i passaggi da 3.1 a3,4 possono essere combinati e pipette può essere tirato con dimensioni desiderate direttamente, senza dover tagliare la punta della pipetta, anche se può risultare più difficile da tirare affidabile pipette con un diametro grande punta e bordi tagliati pulito.
- Sotto un obiettivo 40x, fuoco lucidare la punta della pipetta per un diametro interno di 5 pm usando un filamento riscaldato elettricamente. Una volta terminata, la micropipetta è pronto per essere utilizzato per correnti di registrazione dalla ORNs topo. La resistenza pipetta aperto dovrebbe essere di circa 1 MW quando è riempita di Ringer.
4. Isolamento dei neuroni recettori olfattivi
- Sacrifica un mouse seguendo le linee guida istituzionali e normative. Togliere la testa, staccarsi la pelle che ricopre il cranio e medialmente dividono in due la testa lungo la linea mediana.
- Posizionare i due emi-testa sotto uno stereomicroscopio da dissezione, tirare fuori il setto nasale e rimuovere i turbinati olfattive. Posizionare tutti i tessuti in una piastra di Petri con c glucosioontaining soluzione Ringer mammiferi.
- Sbucciare l'epitelio olfattivo fuori la cartilagine sottostante da due turbinati e trasferire il tessuto in una provetta Eppendorf contenente 250 microlitri Ringer. Usiamo tessuto da 2 turbinati per ottenere la giusta densità di celle per la dimensione della nostra camera di registrazione. Conservare il restante tessuto a 4 ° C per un uso successivo.
- Vortex la provetta Eppendorf contenente l'epitelio olfattivo brevemente per due volte per 1 sec a velocità media. Questo passaggio porta alla dissociazione meccanica delle ORNs dall'epitelio.
- Posizionare la soluzione Ringer contenente le ORNs dissociate nella camera di registrazione. Rimuovere grandi pezzi di tessuto anche presenti nella sospensione utilizzando una pinza sottile.
- Lasciate che i ORNs accontentarsi di 20 minuti prima di iniziare superfusione continua con Ringer e procedere alle registrazioni.
5. Registrazioni
- Abbassare l'elettrodo di aspirazione collegato alla linea di olio nella camera di registrazione e regulmangiato l'altezza del serbatoio dell'olio per stabilire pressione leggermente positiva sulla punta della pipetta. Questo può essere fatto osservando detriti es cella allontanando da (pressione positiva) o verso (pressione negativa) della pipetta. Cercate di non contaminare la punta della pipetta con detriti cellulari.
- Scansione camera di registrazione per un ORN isolato che può essere riconosciuto dalla sua morfologia tipica bipolare utilizzando un ingrandimento di 20-40x. Spostare l'elettrodo di registrazione in prossimità del corpo cellulare ORN. Delicatamente iniziare a succhiare in modo che il corpo cellula entra nella punta della pipetta. Attentamente e lentamente continuare ad applicare l'aspirazione finché il corpo intera cella viene aspirato nella punta della pipetta di aspirazione, lasciando il dendrite e ciglia esposto alla soluzione del bagno. Per le immagini di ORNs aspirati e forme pipetta vedere 7,11. Assicurare che una volta non si effettua l'aspirazione, l'ORN non si muove dentro o fuori della pipetta. Se è così, regolare l'altezza del serbatoio dell'olio conseguenza.
- Utilizzando ilmicromanipolatori, spostare la pipetta di aspirazione dalla sezione contenente le ORNs regolate alla sezione della camera di registrazione. Posizionare accuratamente la pipetta di aspirazione davanti alla canna 3-tubo per lo scambio di soluzione. La pipetta di aspirazione deve essere posizionato abbastanza vicino all'apertura del 3-canna tubo in modo che il ORN è esposto ad un flusso laminare evitando turbolenze e miscelazione per ottenere scambio veloce soluzione. Lo scambio soluzione si ottiene intensificando l'interfaccia tra flussi paralleli di soluzione fluisce attraverso la punta della pipetta di aspirazione. L'andamento temporale del cambio soluzione è tipicamente circa 20 ms, misurata dalla corrente giunzione evocato dal passo della cella tra soluzioni di diversa composizione ionica (vedi fig. 2). Le soluzioni sono forniti da gravità.
6. Risultati rappresentativi
Figura 1. A) recettori neuroni bipolari nel bulbo olfattivo. B) trasduzione del segnale in macchina le ciglia alla fine porta a eccitatori afflusso di corrente. La depolarizzazione conseguente generazione attiva potenziale d'azione al corpo cellulare.
La figura 2 mostra la velocità e l'affidabilità del cambio soluzione. Una pipetta è stata rafforzata dal normale 10% in Ringer diluito per 100 ms e la corrente di giunzione risultante dalla concentrazione di ioni dissimile è stato registrato. Nero traccia è l'averabbia su 5 prove, rosso rintracciare la sua SD. La piccola modifica in SD durante il cambio soluzione dimostra l'affidabilità del cambio soluzione da prova a prova e la mancanza di rumore in eccesso in uno dei flussi soluzione.
La figura 3 mostra una eugenolo indotta risposta da un ORN utilizzando la tecnica della pipetta di aspirazione. La ORN stato esposto a 100 pM eugenolo per 1 secondo, come indicato dalla barra sopra la registrazione. In Fig. 3A (traccia nera) la corrente recettore è stato filtrato con una banda passante 0 - 50 Hz per visualizzare solo il recettore corrente Fig.. 3B mostra la stessa registrazione, ora filtrata alla larghezza di banda larga di 0 - 5000 Hz (traccia rossa) per visualizzare anche potenziali d'azione (AP, indicato dalle frecce). L'inserto mostra la traccia stessa in un lasso di tempo esteso per visualizzare AP più chiaramente al momento della comparsa della risposta.
Figura 4. Risposta famiglia Dose di eugenolo ORN-reattiva (A). Eugenolo è stato utilizzato a concentrazioni comprese tra 0,3 pM a 100 pM, la durata era uno stimolo s e tracce stati filtrati a 0 - 50 Hz. Un progressivo aumento della concentrazione di odorizzante portato ad una risposta più ampia e più veloce, che termina anche più lentamente dopo l'esposizione odorizzante è stata terminata.
ORNs può visualizzare un pattern oscillatorio risposta durante stimolazioni lunghe concentrazioni di odorizzante intermedi (Fig. 4B). Ecco un (3 micron) ORN acetephenone reattiva è stata stimolata per 8 secondi. Dopo una risposta rapida e transitoria picco all'inizio della stimolazione di una serie di piccoli, risposte ricorrenti sono osservati. La larghezza di banda di registrazione è stato 0 - 50 Hz.
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Discussion
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH DC009613, il Programma scientifico frontiera umana e Morley cura Fellowship (JR).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
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