Summary
هذه الطريقة يصف تركيب اندماجي من فيلم polyanhydride القابلة للتحلل والمكتبات وكشف جسيمات متناهية الصغر عالية الإنتاجية من البروتين الإفراج عن هذه المكتبات.
Abstract
Polyanhydrides هي فئة من المواد الحيوية مع توافق مع الحياة ممتازة وقدرات لتقديم الأدوية. في حين تم دراستها على نطاق واسع مع واحد التقليدية عينة في وقت واحد في تقنيات التوليف، وقد وضعت في الآونة الاخيرة عالية الإنتاجية نهج تمكيني تركيب واختبار مكتبات كبيرة من polyanhydrides 1. وسوف يسهل هذا التحسين أكثر كفاءة وعملية تصميم هذه المواد الحيوية للطلبات الأدوية واللقاحات. الأسلوب في هذا العمل يصف تركيب اندماجي من فيلم polyanhydride القابلة للتحلل والمكتبات وكشف جسيمات متناهية الصغر عالية الإنتاجية من البروتين الإفراج عن هذه المكتبات. في هذه الطريقة تعمل آليا (الشكل 1)، يتم التحكم المحركات الخطية والمضخات حقنة من ابفيف، والتي تمكن بروتوكول حر اليدين الآلي، والقضاء على خطأ المستخدم. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن تصنيع البوليمر السريع للمكتبات الصغيرة الحجم، حمراءucing حجم الدفعة بينما مما أدى إلى إنشاء نظم البوليمر المتعددة البدائل. هذا النهج التوافقي لتركيب البوليمر يسهل تركيب ما يصل إلى 15 في مختلف البوليمرات مبلغ يعادل الوقت الذي سيستغرقه لتجميع 1 البوليمر التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون ملفقة مكتبة اندماجي في هندستها البوليمر فارغة أو محملة البروتين، بما في ذلك الأفلام أو النانوية على حل البوليمر في مكتبة المذيبات والهطول في تلك المذيبات غير (للجسيمات الدقيقة) أو عن طريق التجفيف الكهربائية (للأفلام). عند تحميل بروتين ملون تألقي، مترافق في المكتبات البوليمر، يمكن تقييم حركية الافراج البروتين في الإنتاجية العالية باستخدام طريقة الكشف مضان على أساس (أرقام 2 و 3) كما هو موضح سابقا 1. تم التحقق من صحة هذه المنصة اندماجي مع الأساليب التقليدية (2) واتسمت الفيلم polyanhydride والمكتبات جسيمات متناهية الصغر مع
Protocol
1. اندماجي التجميعي مكتبة بوليمر (بوليمر متفاوتة في الكيمياء) - انظر الشكل 1 لإعداد الروبوتية
- حل كل مونومر في (تركيز = 25 ملغ / مل) المذيبات المناسبة وتحميل كل حقنة في الغاز 10CC مشددة.
- إرفاق المذيب قفل إغراء أنابيب شعرية مقاومة للنهاية كل حقنة.
- وضع الحقن في المحاقن مضخات (طلمبات جديدة للبرمجة عصر الحقنة) وقفل في الموقف.
- تعيين المحركات الخطية (Zaber) الى نقطة الانطلاق.
- استخدام المشابك موقف الطوق، وضع نهاية كل أنابيب شعرية في القارورة بدء / بشكل جيد لترسب مونومر.
- بدء برنامج ابفيف التي تضخ كميات متفاوتة من كل مونومر في كل جانب تبعا على تكوين كوبوليمر المطلوب. ويتحقق هذا في البرنامج من خلال الإيعاز إلى المحرك Z-المحور لخفض أنابيب شعرية في قارورة / جيدا ثم كل مضخة في صرف حجم المطلوب. شمال شرقXT، البرنامج يكلف المحرك Z-في العودة إلى وطنه موقف وX-Y-والمحركات للانتقال إلى موقف القارورة التالي / أيضا. ويتم ذلك من كل بئر وحتى حجم المطلوب من مونومر المودعة فيه.
- بعد ترسب مونومر، يتم نقل المكتبة مونومر متعدد جيدا أو متعددة قارورة لفرن ساخن قبل الفراغ والفراغ تحت حضنت لمدة التكثيف رد فعل البلمرة. لCPH: SA التوليف ويتم التفاعل عند 180 ° C، 0.3 عربة، مقابل 1.5 ساعة ولكن هذه ظروف التفاعل بين النظم تختلف البوليمر المختلفة.
2. اندماجي فارغ والبروتين محملة جسيمات متناهية الصغر البوليمر والسينما مكتبة التصنيع - انظر الشكل 1 لإعداد الروبوتية
- يتم تعبئة حقنة في مضخة الحقنة الأولى مع برمجة المذيبات (مكتبة فارغة) أو المذيبات مع البروتين فرقت فيه (البروتين محملة مكتبة) في حين أن حقنة حقنة في 2تبقى مضخة فارغة. تمتلئ لتصنيع أنابيب جسيمات متناهية الصغر في حامل العينة المجاورة مع المذيبات غير (نسبة المذيبات المذيبات غير لمن 1 إلى 100). لتصنيع ويستخدم الفيلم فارغة لوحة متعددة جيدا بدلا من الأنابيب في حامل العينة المجاورة.
- باستخدام برنامج ابفيف، يترسب في قارورة المذيب البوليمر جميع / آبار للمكتبة (تركيز = 20 ملغ / مل) وحضنت لمدة 1-5 دقيقة. ويمكن إدخال خطوة اختيارية صوتنة (30 ق في 40 هرتز) لضمان حل البوليمر كاملة.
- المقبل، من خلال البدء ببرنامج ابفيف منفصلة، يتم سحب العينة في حقنة فارغة، وأودعت في أنبوب المناظر له من جانب غير المذيبات (النانوية) أو فارغة (الأفلام) في حامل العينة المجاورة.
- تتم هذه العملية من أجل كل تكوين مكتبة البوليمر منفصلة.
- ثم يتم وضع جسيمات متناهية الصغر أو مكتبة الأفلام في دائرة الفراغ لإزالة المذيبات المذيبات وغير (وبرة جسيمات متناهية الصغرويمكن أيضا أن تستعاد راي باستخدام الترشيح الفراغ).
3. حركية عالية الإنتاجية البروتين الإصدار
- للتحقيق الإنتاجية العالية حركية الافراج البروتين من مكتبة البوليمر، أن 96 حفر آبار عميقة (2 مل / أيضا)، يتم تعديل وحة البولي بروبلين بحيث الأعلى 1/3 من الجدار بشكل جيد في الأعمدة المجاورة (مثلا: A و B، وتتم إزالة C D، E و F، G و H) لتجاور الآبار. يجب أن تكون ملفقة الأفلام البروتين محملة في الجسيمات النانوية أو نقلها إلى هذه اللوحة لأداء عالية الإنتاجية الإفراج دراسات حركية. يجب فقط عينات البروتين محملة جسيمات متناهية الصغر أو فيلم توضع في واحدة من الأعمدة بشكل جيد المجاورة (مثلا: A، C، E، G و). انظر الشكل 4 لمزيد من التفاصيل.
- بعد نقل الجسيمات النانوية إلى الإفراج وحة 96 حفر آبار عميقة، يسمح للجزيئات لتسوية. يضاف ببطء PBS العازلة (0.1 ملي مول، ودرجة الحموضة 7.4) لكل عينة جيدا (أعمدة A، C، E وG) وبعد ذلك لكل المجاورة أيضا (أعمدة D، B، F، H و) حتى آبار كاملة والمخزن المؤقت هو التدفق الحر بين الآبار المجاورة. للجسيمات الدقيقة، وهذه العملية تحتاج إلى أن تنفذ بمزيد من الحذر لضمان بقاء الجسيمات في الجزء السفلي من العينة جيدا (أعمدة A، C، E وG) وليس نقلها إلى إطلاق سراح المجاورة كذلك (الأعمدة B، D، F وH). في بعض الحالات، هناك حاجة إلى توطين الطرد المركزي العينات جسيمات متناهية الصغر في الجزء السفلي من العينة جيدا (أعمدة A، C، E وG).
- المقبل، وختم البيان وحة بغطاء ووضعها في درجة الحرارة المطلوبة (أي 37 درجة مئوية) تحت التحريض لمدة التجربة.
- في نقاط زمنية تدريجية (أي 0.04 في 1، 2، 3، 5، 7، 9، 12، 15، 19، 24، و 30 يوما) وكميا كمية البروتين ملون تألقي، مترافق صدر باستخدام الماسح نيون 9400 اعصار مسطحة ( GE للرعاية الصحية). تفحص يتم وضع لوحة على سطح إطلاق الماسح الضوئي، وذلك باستخدام الليزر المناسب والإثارة filte الانبعاثاتRS، وكثافة مضان من البروتين الذي صدر في الآبار اطلاق سراح (الأعمدة B، D، F وH) وكميا (كوانت الصورة). يقترح أن يتم تضمين معايير البروتين تركيزات معروفة جيدا في لوحة كمية البروتين لحساب والمحاسبة للتبريد ملون تألقي.
4. ممثل النتائج
على تصنيع البوليمر مكتبة، وقد تم تنفيذ توصيف خارجا مع NMR H 1، المؤتمر الشعبي العام، وFTIR للتحقق من صحة هذه الطريقة اندماجي 1،7،8،11. الجزيئية أوزان تتراوح بين 10،000-20،000 ز / مول، ويتراوح مؤشر التشتت المتعدد 1،5-3،0، وتبين أنها التركيب الكيميائي لتكون دقيقة وبالاتفاق مع الأساليب التقليدية لتجميع polyanhydride 12-15. وبالمثل، أظهرت لقطات SEM من مكتبات النانوية مماثلة مورفولوجيا السطح، الحجم، وتوزيع حجم الجسيمات النانوية والتي ملفقة التقليدية 2. البروتين الإفراج kinetiويتم CS من الجسيمات النانوية polyanhydride أو الأفلام في بئر لوحة تعديل كما هو موضح سابقا 1. كشفت نتائج تقريبي الإفراج أجل الصفر مع أو بدون دفعة تعتمد على البروتين والتحميل كيمياء البوليمرات (أرقام 2 و 3) 1،12،14،16.
الشكل 1. فيلم البوليمر اندماجي وجسيمات متناهية الصغر جهاز تلفيق.
الشكل 2 عالي الإنتاجية الإفراج عن المصل البقري تكساس الأحمر الزلال (TRBSA) من CPH: SA مكتبة جسيمات متناهية الصغر البوليمر. SA الغنية كيمياء البوليمر الإفراج مغلفة TRBSA بسرعة أكثر، في حين CPH كيمياء البوليمر الغنية الافراج عن أبطأ. أشرطة الخطأ تمثل معيار ديفيانشوئها ون = 4. طبع بإذن من وآخرون بيترسن. آل 1. جميع الحقوق محفوظة 2010 الجمعية الكيميائية الأمريكية.
الشكل 3 عالي الإنتاجية الإفراج عن المصل البقري تكساس الأحمر الزلال (TRBSA) من CPTEG: CPH مكتبة أفلام البوليمر. CPTEG كيمياء البوليمر الغنية الإفراج مغلفة TRBSA بسرعة أكثر، في حين CPH كيمياء البوليمر الغنية الافراج عن أبطأ. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري ون = 3.
الشكل 4. صورة تظهر بئرين المجاورة "قبل" و "بعد" التعديل في لوحة البولي بروبلين 96 في أعماق حفر آبار. "بعد" صورة التعديل على الحق يصور أيضا إضافة فيلم البوليمر (أسفل اليسار أيضا) مع جزيء من الفلورسنت مغلفةأن يطلق سراحه بين بئرين في حل العازلة. تم الكشف عن جزيء ثم أفرج الفلورية في الحق أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معرفة الشروط اللازمة وتجميع درجات الحرارة التحول الزجاجي (T ز ق) من البوليمرات يجري تصنيعه ضرورية لتصنيع المكتبة. إذا كان T ز ق هي أقل من درجة حرارة الغرفة، قد تحتاج الخطوة تصنيع جسيمات متناهية الصغر التي يتعين الاضطلاع بها في بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة تحت ز T من البوليمرات. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي اتخاذ الحذر للتأكد من أن جميع المعدات التي تأتي في اتصال مع ارتفاع درجات الحرارة والمذيبات ويجب أن يكون لائقا للتعامل مع هذه الظروف. ويمكن تعديل العديد من المعلمات من هذا البروتوكول (أي درجة الحرارة، وفراغ، وأوقات الحضانة، والمذيبات، المذيبات غير، تركيز البوليمر، نسب إلى المذيبات غير المذيبات، الخ) لاستيعاب أنظمة البوليمر مختلفة لتخليق أو الجسيمات / الفيلم تلفيق. في بعض الحالات، الجسيمات النانوية ليست مستقرة في المذيبات لفترات زمنية طويلة (كافية لإزالة المذيبات من فراغ التجفيف) حتى 2 REM المذيبات البديلةويمكن استخدام طرق البيضاوي. 1) من الممكن طرد الجزيئات ببطء، مصبوب المذيب طاف، والجزيئات المتبقية المجففة أو 2) يمكن فصل الجزيئات عن طريق الترشيح فراغ ثم تجفف. ويمكن إجراء تصنيع التالية من الجسيمات النانوية فارغة أو محملة البروتين-/ الأفلام، وتوصيف عالية الإنتاجية أو اختبار لفحص المواد الحيوية للبروتين، الخليوي، أو تفاعلات المضيف. هذه المنهجية عالية الإنتاجية تمكن التحسين السريع للمادة بيولوجية لأداء التطبيق المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف جائزة ONR-موري (NN00014-06-1-1176) والولايات المتحدة للبحث الطبي العسكري والعتاد القيادة (منحة رقم W81XWH-10-1-0806) للحصول على الدعم المالي. ويستند هذه المواد على العمل بدعم من مؤسسة العلوم الوطنية في إطار منحة رقم 0552584 وEEC 0851519.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
