Summary
Bu yöntem biyolojik polianhidrid film ve nanoparçacık kütüphanelerin kombinatoryal sentezi ve bu kütüphanelerin protein serbest high-throughput algılama anlatılmaktadır.
Abstract
Polyanhydrides mükemmel biyouyumluluk ve ilaç dağıtım yetenekleri ile biyomalzemelerin bir sınıf vardır. Onlar ile kapsamlı araştırmalar yapılmış olsa da, geleneksel tek-örnek-bir-zamanda sentez teknikleri, daha yeni high-throughput yaklaşım polyanhydrides 1 büyük kütüphaneler sentez ve test edilmesi için geliştirilmiştir. Bu daha verimli optimizasyon ve ilaç ve aşı dağıtım uygulamaları için bu biyomalzemelerin tasarım süreci kolaylaştıracaktır. Bu çalışmada yöntem biyolojik polianhidrid film ve nanoparçacık kütüphanelerin kombinatoryal sentezi ve bu kütüphanelerin protein serbest high-throughput algılama anlatılmaktadır. Bu robot ameliyat yöntemi (Şekil 1), lineer aktüatörler ve şırınga pompaları kullanıcı hatası ortadan kaldırarak, bir hands-free otomatik protokolü sağlayan LabVIEW, tarafından kontrol edilir. Dahası, bu yöntem, mikro ölçekte polimer kütüphanelerinin hızlı üretim, kırmızı sağlarmultivaryan polimer sistemlerinin kurulması ile sonuçlanan süre toplu iş boyutu ucing. Bu polimer sentezi için kombinatoryal yaklaşım geleneksel olarak bir polimer sentezlemek için alacağı zaman eşdeğer bir miktar içinde 15 farklı polimer kadar sentezini kolaylaştırır. Buna ek olarak, kombinatoryal polimer kütüphanesi (nanopartiküller için) olmayan bir çözücü içinde ya da vakum kurutma (filmleri için) bir çözücü ile çökeltme olarak polimer film ya da kütüphane çözünme üzerine boş veya nano partiküller içeren protein yüklü geometrilere imal edilebilir. Polimer kütüphaneler içine bir florokrom-konjuge protein yükleme sonra, protein serbest bırakma kinetikleri daha önce tarif edildiği gibi 1, bir floresan merkezli tespit yöntemi, (Şekil 2 ve 3) kullanılarak yüksek işlem de tespit edilebilir. Bu kombinatoryal platformu geleneksel yöntemlerle valide edilmiş 2 ve polianhidrid film ve nanoparçacık kütüphaneler ile karakterize edilmiştir
Protocol
1. Kombinatoryel Polimer Kütüphane Sentezi (Polimer Kimyası Değişen) - Robotik Kurulum için Şekil 1'e bakınız
- Uygun bir çözücü (konsantrasyon = 25 mg / ml) her bir monomer çözülür ve bir 10cc gaz geçirmez şırınga içine her bir yük.
- Her bir şırınga sonuna kadar çözücü dirençli yem kilit kılcal tüpler takın.
- Şırınga pompaları (New Era Programlanabilir Şırınga Pompaları) üzerinde şırınga yerleştirin ve yerine kilitleyin.
- Başlangıç pozisyonuna lineer aktüatörler (Zaber) ayarlayın.
- Halka standı kelepçeler kullanarak, monomer birikim için / de başlayan şişenin içine kılcal tüpler hem sonuna yerleştirin.
- Her hangi sıra istenilen kopolimer bileşimi bağlı olarak pompalar her monomer değişken hacimler LabVIEW programı, başlatın. Bu, istenen hacim dağıtmak için, şişeyi / iyi ve daha sonra her bir pompa içine kılcal tüpler düşürmek için Z ekseni çalıştırıcı tarafından talimat programı ile elde edilir. Next, program / de sonraki flakon konuma taşımak onun ev konumu ve X ve Y-aktüatörler dönmek için Z-aktüatör bildirir. Her bir kuyucuğa monomer istenen hacmi içine tevdi kadar bu gerçekleştirilir.
- Monomer çökelme sonra, çok iyi bir ya da çok-vial monomer kütüphane Önceden ısıtılmış bir vakumlu fırın transfer edilir ve yoğunlaşma polimerizasyon tepkime süresi boyunca vakum altında inkübe edildi. Için CPH: SA 1.5 saat için sentez reaksiyon 180 yürütülür ° C de, 0.3 torr, ancak bunlar reaksiyon koşullarında farklı polimer sistemleri arasında değişir.
2. Kombinatorik Boş ve Protein yüklü Polimer Nanopartikül ve Film Kütüphanesi İmalat - Robotik Kurulum için Şekil 1'e bakınız
- Birinci programlanabilir şırınga pompası, şırınga, bir çözücü ile doldurulmuş (boş kütüphane) veya protein ile bir çözücü ikinci enjektör içinde enjektör iken (Protein yüklü kütüphane) içinde dağılırPompa boş bırakılır. Bitişik numune tutucu içinde nanoparçacık imalatı için tüpler olmayan çözücü ile doldurulur (olmayan çözücü ile çözücü oranı 1 100). Filmin imalatı için bir boş çok-plaka bitişik numune tutucu içindeki tüpler yerine kullanılmaktadır.
- LabVIEW programı kullanarak, çözücü kütüphanenin her şişe polimer / kuyucuk (konsantrasyon = 20 mg / ml) içine tevdi ve 1-5 dakika için inkübe edilir. İsteğe bağlı sonication adım (40 Hz'de 30 sn) tam polimer çözünmesi sağlamak için tanıttı olabilir.
- Sonra, ayrı bir LabVIEW programı başlatarak, örnek boş enjektöre çekilir ve bitişik numune tutucu olmayan çözücü (nanopartiküller) veya boş kuyu (film) karşılık gelen bir tüp içine yatırılır.
- Bu işlem, farklı polimer kütüphanesinin her bir bileşim için gerçekleştirilir.
- Nanopartikül filmin veya kütüphane sonra çözücü ve çözücü olmayan çıkarılması (nanoparçacık Terazi için bir vakum odasına yerleştirilirry de) vakum filtrasyonu kullanılarak telafi edilebilir.
3. Yüksek throughput Protein Yayın Kinetiği
- , Bir polimer kütüphane yüksek verimli protein serbest bırakma kinetikleri araştırmak için bir 96 (2 ml / çukur) derin doldu, polipropilen levha değiştirilmiş öyle ki üst komşu sütun iyi duvar 1/3 '(örn: A ve B, C ve D, E, F, G ve H) kuyulara bitişik için alınır. Protein yüklü filmlerde fabrikasyon veya nanopartiküller high-throughput sürüm kinetiği çalışmaları gerçekleştirmek için bu plaka içine aktarılması gerekir. Protein yüklü nanoparçacık veya film örnekleri sadece bitişik sütunları (: A, C, E ve G ex) çok iyi birine yerleştirilmelidir. Ayrıntılar için Şekil 4'e bakın.
- 96 derin dolmuştu release plaka nanoparçacıkların devrinden sonra, parçacıkların yerleşmek için izin verilir. PBS tamponu (0.1 mM, pH 7.4) her biri yavaş yavaş komşu sıra (kolon B, D, sonra da her bir numuneye eklenir (kolon A, C, E ve G) ve bir, F ve H) kuyu tam ve tampon bitişik kuyu arasında serbest akışlı olana kadar. Nanopartiküller, bu süreç, parçacıkların numunenin alt sıra (kolon A, C, E ve G) ve bitişik serbest bırakma aktarılır değil de (kolon B, D, F kalmasını sağlamak için ilave dikkatli bir şekilde yapılması gerekmektedir , ve H). Bazı durumlarda, santrifüjleme (kolon A, C, E ve G) 'de örnek altındaki nanoparçacık örnekleri tespit etmek için gereklidir.
- Daha sonra, serbest bırakma plaka bir kapak ile kapatılmış ve deney süresi boyunca ajitasyon altında istenen sıcaklıkta (örn. 37 ° C) yerleştirilir.
- Artan zaman noktalarında (yani 0.04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, ve 30 gün) 'de açıklanması florokrom-konjuge protein miktarı, bir tayfun 9.400 Düz Floresan tarayıcı (kullanarak ölçülür GE Healthcare). Salma plakasını tarayıcı yüzeyine yerleştirilir, uygun uyarma lazer ve emisyon filte kullanılarak tarananrs ve serbest kuyular (sütun B, D, F ve H) (Görüntü Quant) ölçülür yılında yayımlanan proteinin floresan yoğunluğu. Bilindiği konsantrasyonlarda protein standartları florokrom söndürülmesi için protein miktarı ve muhasebe hesaplanması için plaka dahil edilmesi önerilmektedir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Polimer kütüphane imalat üzerine, karakterizasyonu kombinatoryal yöntemi 1,7,8,11 doğrulamak için 1H NMR, GPC ve FTIR ile yürütülmektedir. 10,000-20,000 Moleküler ağırlık aralığı g / mol, polidispersite indeksi aralıkları 1.5-3.0 dan, ve kimyasal bileşim doğru ve polianhidrid sentez 12-15 için geleneksel yöntemler ile uyum içinde olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde, nanopartiküller kütüphanelerin SEM görüntüleri benzeri bir yüzey morfolojisi, boyut ve geleneksel olarak imal edilmiş nanopartiküller 2'ye kadar boyut dağılıma sahip olduğunu göstermiştir. Protein serbest kinetipolianhidrid veya nanopartiküller filmler Cs daha önce tarif edildiği gibi 1 modifiye edilmiş bir plaka içinde gerçekleştirilir. Elde edilen sonuçlar ile birlikte ya da protein yükleme ve polimer kimyası (Şekil 2 ve 3) 1,12,14,16 bağlı olarak bir çoğuşma olmaksızın, yaklaşık sıfır dereceden bir salınma saptandı.
Şekil 1. Kombinatorik polimer film ve nanoparçacık üretim cihazları.
Şekil 2 CPH albümin Texas Red sığır serumu (TRBSA) Yüksek throughput sürümü:. SA polimer nanoparçacık kütüphanesi. CPH zengin polimer kimyaları yavaş bırakın ise SA-zengin polimer kimyası, en hızlı TRBSA kapsüllü bırakın. Hata çubukları standart sapma temsiltion ve n = 4. Petersen ve arkadaşları izni ile yayımlanmaktadır. ark. 1. Copyright 2010 American Chemical Society.
Şekil 3 CPTEG albümin Texas Red sığır serumu (TRBSA) Yüksek throughput sürümü:. CPH polimer film kütüphanesi. CPH zengin polimer kimyaları yavaş serbest iken CPTEG zengin polimer kimyası, en hızlı TRBSA kapsüllü bırakın. Hata çubukları standart sapma ve n = 3 temsil eder.
Şekil 4. "Önce" İki komşu kuyu gösteren resim ve 96 derin dolmuştu polipropilen plaka "sonra" değişiklik. Sağdaki "sonra" değişiklik dosyasını da kapsüllü floresan molekülü ile bir polimer film (sol kuyunun alt) ek gösteriyorBir tampon çözelti içine iki kuyu arasındaki serbest bırakılması. Serbest floresan molekül ardından sıra sağ algılanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gerekli sentez koşulları ve sentezlendiği polimerlerin cam geçiş sıcaklığı (T g s) bilgisi kütüphane üretimi için gereklidir. T g s oda sıcaklığının altında olması durumunda, nanoparçacık imalat adımı polimerlerin T g altında bir sıcaklık kontrollü bir ortamda gerçekleştirilebilir gerekebilir. Ayrıca, dikkatli yüksek sıcaklık ve solvent ile temas tüm ekipmanların bu koşullar işlemek için uygun olmalıdır sağlamak için alınmalıdır. Bu protokol parametrelerini çeşitli sentez ya da parçacık / film için farklı polimer sistemlerine yerleştirmek için (örneğin, sıcaklık, vakum, inkübasyon sürelerinde, çözücü maddeler, non-solvent, polimer yoğunluğunun, non-çözücü ile çözücü oranları, vs) ayarlanabilir fabrikasyon. Bazı durumlarda, nanopartiküller (vakum kurutma ile çözücü çıkarma işlemi için yeterli) uzun zaman periyotları için çözücü olarak stabil değildir bu nedenle, iki alternatif çözücü aynioval şekli kullanılabilir. 1) yavaş yavaş parçacıklar, santrifüj süpernatant çözücü dökülmüş ve geri kalan parçacıklar kurutuldu ya da 2) parçacıklar, vakumla süzülerek ayrılabilir ve daha sonra kurutulabilir. Boş veya protein yüklü nanopartiküller / filmler, yüksek-throughput karakterizasyonu veya test takiben imalat protein, hücresel ya da konak etkileşimleri için biyomalzemeler ekrana yapılabilir. Bu durum, yüksek verim metodoloji istenen uygulama için biyomalzemenin performansı hızlı uygun hale getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar mali destek için ONR-MURI Ödülü (NN00014-06-1-1176) ve US Army Medical Research ve Materyal Komutanlığı (Hibe No W81XWH-10-1-0806) kabul etmektesiniz. Bu malzeme Hibe sayılı AET 0552584 ve 0851519 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma dayanır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
