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Biology

Protease e catalisada por ácido Workflows Labeling Empregando Published: February 20, 2013 doi: 10.3791/3891
Automatic Translation
1, 1
1Boston Biomedical Research Institute

Summary

Fluxos de trabalho de isótopos estáveis ​​de rotulagem empregando

Abstract

Isótopos estáveis ​​são ferramentas essenciais em espectrometria de massa biológica. Historicamente, 18 O-isótopos estáveis ​​têm sido extensivamente utilizadas para estudar os mecanismos catalíticos das enzimas proteolíticas 1-3. Com o advento da espectrometria de massa à base de proteomics, a incorporação catalisada enzimaticamente, de 18 átomos de O-água isotopicamente enriquecido estável tornou-se um método popular para comparar quantitativamente os níveis de proteína de expressão (revisto por Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-rotulagem constitui uma alternativa simples e de baixo custo para produtos químicos (por exemplo iTRAQ, ICAT) e metabólicas (por exemplo, técnicas de SILAC) rotulagem 7. Dependendo da protease utilizada, 18 O-rotulagem podem resultar na incorporação de até dois átomos de O-18 no grupo carboxilo C-terminal do produto de clivagem 3 8. Em nossa Paleo (p rotease-a e Abeling ssisted l mploying 18 O enriquecido água) adaptação de enzimática 18 O rotulagem, utilizamos 50% de água 18 O enriquecido para produzir assinaturas isotópicas distintas. Em combinação com a alta resolução de laser assistida por matriz de ionização de dessorção de tempo-de-voo espectrometria de massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), os envelopes isotópicos característicos podem ser usados ​​para identificar os produtos de clivagem com um elevado grau de especificidade. Nós já ter usado o Paleo metodologia para detectar e caracterizar proteases endógenas 9 e monitorar reações proteolíticas 10-11. Desde Paleo codifica a própria essência da reação de clivagem proteolítica, a instalação experimental é Enri simples e bioquímicoschment passos de produtos de clivagem podem ser contornados. A paleo-método pode ser facilmente estendido para (i) o curso experiências que monitoram a dinâmica de reações de clivagem proteolítica e (ii) a análise da proteólise em amostras biológicas complexas que representam condições fisiológicas. Paleo-TimeCourse experimentos ajudar a identificar passos limitação de taxa de processamento e intermediários de reação em complexas reações via proteolíticas. Além disso, a reacção de Paleo permite-nos identificar as enzimas proteolíticas como a tripsina serina-protease que é capaz de associar novamente os seus produtos de clivagem e de catalisar a incorporação de um 18 segundo O-átomo. Tais "etiquetagem dupla" enzimas podem ser utilizados para postdigestion 18 O-rotulagem, em que os péptidos marcados são exclusivamente através da reacção de oxigénio carboxil troca. A nossa estratégia terceira estende rotulagem empregando água 18 ó enriquecido além enzimas e utiliza condições de pH ácido para introduzir 18 sinal isótopo estável O-Atures em peptídeos.

Protocol

Os apresentados Leo-workflows permitem a rotulagem de isótopos estáveis ​​de proteína digere e peptídeos sintéticos. Estas experiências de cursos de tempo (Figura 1) são aplicáveis ​​a estudos comparativos e quantitativa do proteoma, bem como pesquisas protease. Cada fluxo de trabalho é constituído por duas etapas experimentais (figura 2): A) O tempo de amostragem do respectivo resolvido 18O-stable isotope reacção codificado (protease catalisada clivagem do péptido; protease catalisada reacção de permuta de oxigénio carboxilo; catalisada por ácido a troca de oxigénio carboxil reacção) e B), análise por espectrometria de massa e a representação gráfica de 18 S-cinética de incorporação.

TimeCourse Experimentos A.

I. paleo-TimeCourse: rotulagem Protease catalisada de clivagens proteolíticas

  1. (Opcional) ligações de dissulfureto de proteínas (10 ^ M) e os péptidos (250 nM) são reduzidas com DTT (concentração final 2,5 mM)em 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recentemente preparada) por incubação durante 30 min a 50 ° C.
  2. (Opcional) cisteínas livres são alquiladas com iodoacetamida (concentração final 10 mM) em 25 mM NH 4 HCO 3 por incubação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
  3. Dependendo protease de interesse, proteína / peptídeo soluções precisam ser limpos-se para remover o tampão residual e agente de alquilação. Use colunas PepClean C-18 (Thermo rotação) para a limpeza do peptídeo e concentradores Vivaspin centrífuga (Sartorius) para troca de tampões para as amostras de proteína.
  4. Redissolver / peptídeos / proteínas de câmbio em 20 ul de tampão de reacção da protease (ECE-1: 50 mM de MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contendo 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
  5. Retirar uma amostra de ponto de tempo zero, antes da adição da protease: Misturar 0,5 ul da mistura de reacção e 0,5 ul alfa ciano-4-hidroxicinâmicoácido matriz (10 mg / ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Ponto de amostra numa placa de Opti-TOF MALDI alvo 384 (AB SCIEX) e deixar as gotas de solvente à temperatura ambiente até estar seco (cerca de 5 min).
  6. Dividir a solução de reacção em duas aliquotas. A primeira alíquota será incubado com a protease de interesse (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM), à temperatura ambiente ou a temperatura recomendada para a enzima em particular. A segunda alíquota serão incubadas sem protease e servirá como amostra de controlo. A primeira alíquota da amostra representa um padrão para a protease catalisada 18 O-rotulagem e podem ser usados ​​para identificação de péptidos e proteínas, a detecção de actividades proteolíticas e monitorização das reacções de clivagem proteolitica. A segunda alíquota é utilizada para demonstrar que 18 O-incorporação é induzida pela protease e, portanto, nem a rotulagem nem clivagem é esperado para esta amostra.
  7. Seguir a reacção por remoção de aliquotas da reacção e localizá-los como described no passo 5 em intervalos de tempo como parece em forma. As condições de reacção descritas acima são utilizados para monitorizar a reacção proteolítica por até quatro dias (aproximadamente 24 pontos). Iniciar a amostragem a cada 5 min até 30 min, em seguida, detectar a cada 30 minutos até 2 horas, depois a cada hora até 8 horas e a cada 8 horas até 4 dias. Produtos de clivagem deve aparecer dentro do primeiro 12 hr e do substrato deve ser completamente hidrolisada após 24 hr. Tempos de incubação prolongados de reacção permitem definir os produtos de reacção que são estáveis ​​discretos a partir de intermediários da reacção, os quais são posteriormente processados. Dependendo questão de pesquisa e dados enzima-substrato pares, manchar vezes e temperatura de incubação tem que ser modulada para assegurar amostragem reação ideal.
  8. Após o ponto de tempo final de reacção é manchado ou em intervalos longos entre manchar, a placa alvo de MALDI é submetido a análise MALDI-TOF/TOF MS / MS como descrito a seguir (Secção B).

II. Paleo-TimeCourse: Postdigrotulagem estion de terminais proteolíticas

  1. (Opcional) ligações de dissulfureto de proteínas (10 ^ M) e os péptidos (250 nM) são reduzidas com DTT (concentração final 2,5 mM) em 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos preparados na hora) por incubação durante 30 min a 50 ° C.
  2. (Opcional) cisteínas livres são alquiladas com iodoacetamida (concentração final 10 mM) em 25 mM NH 4 HCO 3 por incubação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
  3. Dependendo da protease de interesse, proteína / peptídeo soluções precisam de ser limpas-se para remover o tampão residual e do agente de alquilação. Use colunas PepClean C-18 de spin para limpeza de peptídeo e Vivaspin concentradores centrífugos para troca de tampão proteína.
  4. Redissolver / trocar os produtos limpa-up peptídeos / proteínas em 20 ul de tampão de reacção (por exemplo, protease tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) e digestão com protease de interesse para finalização (por exemplo, tripsina: 0,04 nM, 37 ° C, 12 hr).
  5. Limpeza produtos de clivagem com colunas PepClean C-18 spin. Esta etapa irá eliminar atividades de protease residuais.
  6. Redissolver / trocar os produtos limpa-up peptídicas em 20 ul de tampão de reacção da protease (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contendo 1:1 (v / v) final H 2 O. 18
  7. Retirar uma amostra de ponto de tempo zero, antes da adição da enzima: mistura de 0,5 ul da mistura de reacção e 0,5 ul alfa matriz de ácido ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg / ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Ponto de amostra numa placa alvo de MALDI e deixar as gotas de solvente à temperatura ambiente até estar seco (cerca de 5 min).
  8. Dividir a solução de reacção em duas aliquotas. A primeira alíquota será incubado com protease de interesse (por exemplo, tripsina: 0,04 nM), à temperatura ambiente ou a temperatura recomendada para a enzima em particular. A segunda alíquota serão incubadas sem protease e vai servir como um controlo. O primeiroalíquota representa uma amostra padrão de etiquetagem 18 protease catalisada postdigestion O-e pode ser utilizado para a quantificação de peptídeos e proteínas. A segunda alíquota é utilizada para demonstrar que 18 O-incorporação é catalisada pela protease e, portanto, não é esperado de rotulagem para esta amostra.
  9. Seguir a reacção por remoção de aliquotas da reacção e localizá-los, tal como descrito no passo 7.) Em intervalos de tempo como parece adequada. Por exemplo, nós descoberto inicialmente a cada 5 min durante um período máximo de 30 minutos e a cada 15 minutos depois disso para monitorizar a reacção de permuta de oxigénio carboxil catalisada pela tripsina.
  10. Após o ponto de tempo final de reacção é manchado ou em intervalos longos entre manchar a placa alvo de MALDI é submetido a análise MALDI-TOF/TOF MS / MS como descrito a seguir (Secção B).

III. Aleo TimeCourse-: catalisada por ácido de rotulagem de grupos carboxilo

  1. Incubar péptidos individuais (50 nM) com 1:1 (v / v) de água 18 O-enriquecido em tele presença ou ausência (controlo) de 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético final (volume total 30 ul).
  2. Os produtos de reacção de amostra diários durante 48 dias, por co-spotting uma alíquota de 0,5 ul da mistura de alfa 0.5μl com matriz de ácido ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg / ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA), directamente para um alvo MALDI placa.
  3. Entre os intervalos de manchas e após avistar, do ponto final do tempo de reação apresentar MALDI placa-alvo para MALDI-TOF/TOF análise MS / MS, conforme descrito abaixo na Secção B.

B. MALDI-TOF/TOF MS / MS de Aquisição de Dados e Análise

  1. Espectros de massa são adquiridos em um 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
  2. Antes da análise, o instrumento é calibrado com uma mistura de padrões de peptídeos (Kit de calibração para Padrões de Massa de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos) com um máximo de tolerância do erro de medição de massa de ± 50 ppm e um número mínimo de seis picos para corresponder.
  3. Os espectros de MS (intervalo de massas400 - 4000 m / z) são adquiridos em triplicado usando o modo de ião positivo com uma intensidade do laser ajustável (3400 - 3800; tamanho do passo 50), com uma gama aceitável a intensidade de base do pico de 2.000 - 45.000. Fotos individuais são adquiridos para espectros sub-, com 400 tiros total / espectro, parar condições entram em vigor depois de 800 sub-espectros são adquiridos (aprovação ou reprovação) ou 400 sub-espectros critérios de aceitação da passagem. No caso de amostras de baixa abundância ou na presença de complexos origens biológicas da extremidade inferior da gama de detecção MS deve ser aumentada para 800 m / z. Além disso, pode ser necessário para remover o sal e outros compostos que interferem com a etapa de limpeza de amostra, como descrito anteriormente, ou por separação por LC.
  4. Arquivos de dados (MS. T2D arquivos) são exportados da Série Explorador 4000 software de aquisição de dados e importados para o nosso sistema de informações interno de laboratório, que utiliza software MASCOTE Distiller (Matrix Science) para processamento espectral e detecção de pico. Envelopes isotópicassão deconvoluted e 18 ó incorporação rácios automaticamente determinadas usando um algoritmo semelhante ao descrito por Mason et al. 12 e adaptado pelo nosso grupo de 9. Em alternativa, as ferramentas de software, tais como 13 e ZoomQuant Viper 14, bem como os pacotes de software comercial tais como BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) e Distiller Mascot Quantitation Toolbox (Matrix Science) pode deconvolute 18 O tipo de dados 15,16. 18 ó incorporação rácios são expressos como as contribuições relativas dos isótopos individuais espécies de péptidos (isto é, péptidos contendo 16 ó, 18 ou 18 O 1 O 2) a todo o envelope isotópica.
  5. Para cada experiência TimeCourse, as massas moleculares ([M + H] +) para todas as espécies de péptidos detectados são extraídos a partir dos ficheiros de dados associados MS e os valores binned a uma largura de 100 ppm em massa.
  6. AAo menos três [M + H] estão definidos para ser obrigado a preencher um escaninho. No caso de substratos conhecidos, a lista bin filtrado é comparado com uma lista de produtos de clivagem proteolítica previsto a partir da sequência de péptido de substrato utilizando a ferramenta FindPept ExPASy 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) e um 200 ppm em massa de tolerância de erro aceitação.
  7. Espectros MS / MS são adquiridos para todos os valores de massa dos produtos de clivagem previstos pela ferramenta FindPept e para valores de bin que têm 18 O-incorporações que lhes estão associados. MS / MS de dados são adquiridos em 4800 MALDI Analyzer TOF / TOF em 1kV modo íon positivo refletor, com uma intensidade do laser fixa de 4200 e de gás-CID em modo desligado. 50 disparos são adquiridos num padrão aleatório por espectros de sub--se a um total de 40 sub-espectros por local (produzindo um total de 2.000 disparos / local).
  8. MS / MS arquivos de dados (. T2D arquivos) são exportados a partir da série 4000 Explorer software de aquisição de dados e importados para o sistema de informação laboratorial em casa, os picos são detectados e listas de MS / MS dos picos estão associados com os dados correspondentes binned MS.
  9. Para identificação peptídeo, listas de MS / MS de pico são pesquisados ​​no banco de dados SwissProt usando o motor de busca MASCOTE com os parâmetros de pesquisa a seguir: não especificidade enzima, 150 ppm e íon precursor 0,2 fragmento Da tolerâncias de massa de íons.
  10. Identificações peptídeos podem adicionalmente ser validado com o Data Explorer software (AB SCIEX), confirmando as características 18 O incorporação padrões de íons através y série de fragmentos, como descrito por Shevchenko et al. 18.

C. Preparação do Tempo espectral e 18 Ó incorporação de parcelas

Parcelas de tempo espectrais: arquivos de dados (MS. T2D arquivos) para cada ponto de tempo de reação são exportados do software Data Explorer como ASCII-arquivos usando ummacro e importados para um programa de análise de dados e software gráfico (por exemplo de origem por OriginLab) e exibido como parcelas de cascata (Figura 3).

18 O-incorporação parcelas: Para cada um dos produtos de clivagem do péptido binned, as contribuições relativas das espécies de isótopos de péptidos individuais (16 O, 18 O 18 O 1 ou 2) são extraídos através de todos os pontos de tempo de reacção e representada graficamente em função do tempo (Figura 4).

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Representative Results

Utilizou-se o fluxo de trabalho Paleo TimeCourse para monitorar dinamicamente a incorporação de 18 O-isótopos estáveis ​​em produtos de clivagem de péptidos geradas por enzimas proteolíticas. A abordagem apresentada é uma ferramenta versátil para estudar comparativamente vias de processamento proteolíticas de diferentes substratos e combinações de protease. Por amostragem reacções proteolíticas repetidamente durante o curso da reacção, o experimento Paleo TimeCourse fornece instantâneos resolvida no tempo de substrato e de produto e as abundâncias detalhes de processamento. Co-manchando amostras com uma solução de matriz ácida em uma placa-alvo pára a reacção enzimática e cristalização matriz ainda preserva composição da amostra. Por conseguinte, os pontos de tempo pode ser retrospectivamente analisada por MALDI-TOF/TOF MS / MS depois de conclusão da reacção enzimática. Para acomodar a natureza rica em dados experimentais desses fluxos de trabalho, foi implementado um sistema semi-automático de bioinformática que calcula 18 O-incorporandorazões entre iões para cada peptídeo Figura 3. mostra um gráfico representativo espectral curso de tempo do processamento do peptídeo C Endokinin por ECE-1. Paleo TimeCourse-dados é multidimensional: A vista expandida dos dados de MS em toda a gama de massa inteira simultaneamente mostra a abundância do substrato péptido, bem como a abundância de produtos peptídicos. A disposição temporal permite decifrar a sequência de eventos de clivagem e de determinar qual fragmentos peptídicos são produtos de dissociação estáveis. O zoom-tendo em conta a dados de MS revela os envelopes de isótopos de cada peptídeo e a clivagem induzida por 18-O rótulo é prontamente identificado pelo seu isótopo distribuição característica. 18O-rotulagem permite uma selecção positiva de produtos de clivagem para posterior identificação por MS / MS. No total, o ensaio Paleo TimeCourse capta a dinâmica de processamento proteolítico e permite avaliar a locais de clivagem por proteases preferidas. Outro nível de informaçãoção pode ser obtido de acordo com o mecanismo enzimático da protease utilizada. Certas proteases tais como a tripsina serina protease é capaz de covalentemente religação seus produtos de clivagem de péptidos. . A hidrólise dos acil-enzima resultados intermédios da incorporação de um segundo 18 O-átomo no grupo carboxilo C-terminal A Figura 4 mostra as alterações resultantes na contribuição relativa dos isotopómeros diferentes ao longo do tempo: O péptido de reacção inicial clivagem de ligação resulta numa separação de 1:1 entre o O 16 e 18 O 1 fracções peptídicas. Os carboxilo oxigénio câmbio reacção resulta do aumento da fracção de 18 O 2 à razão de 25% em equilíbrio com uma concomitante diminuição da fracção de O 16. Proteases capazes de catalisar a reacção de permuta de oxigénio carboxilo pode, portanto, ser utilizado para um fluxo de trabalho adicional 18 O-rotulagem, o rótulo postdigestion de ter proteolíticamini. Nestes tipos de experiências, os substratos são inicialmente digerido na ausência de H 2 18 O, produtos peptídicos limpos e incubaram-se com um novo lote de protease, mas desta vez na presença de 50% de H 2 O. 18 A Figura 4 mostra o diferenças na incorporação de isótopos que podem ser observadas nestes dois fluxos de trabalho experimental, e as diferenças na velocidade de incorporação entre os substratos peptídicos individuais. No fluxo de trabalho postdigestion rotulagem, a taxa para ambos 18 O-incorporações é determinada pela reacção de troca de oxigénio carboxilo. A velocidade de reacção depende de quão rapidamente a protease interactua com os seus produtos de clivagem. A afinidade para o produto de reacção pode ser utilizada indirectamente para inferir a afinidade da protease para o substrato péptido original. Essa informação pode ser útil para determinar quais seqüências de peptídeos são substratos ideais por exemplo para tríptica digere em estudos quantitativos proteômica. Peptides que são prontamente clivados e duplamente marcada com tripsina são susceptíveis de serem péptidos que são proteotypic reprodutível e quantitativamente formado e, portanto, adequado para estudos comparativos proteomics.

A um pH baixo, a troca oxigénios dos grupos de ácido carboxílico com o solvente aquoso 19-20. Esta reacção pode ser usada como uma abordagem alternativa para a protease catalisado-rotulagem estratégias para introduzir isótopos estáveis ​​em peptídeos. No Aleo TimeCourse-(ácido catalisada rotulagem empregando 18 O enriquecimento de água) de fluxo de trabalho, acompanhamos a lenta incorporação de 18 de O-átomos em peptídeos sintéticos. A troca de oxigénio catalisada por ácido parado após a co-cristalização com a solução de matriz na placa alvo de MALDI, de forma eficaz "congelar" o estado de distribuição isotópica. Utilizou-Angiotensina 1 como um modelo de péptido e examinou seu envelope isótopo ao longo do tempo (Figura 5). Uma absorção de dois átomos de O-18 para cada carrogrupo boxyl foi observada. Sob as condições experimentais, a reacção catalisada por ácido carboxílico troca de oxigénio foi muito mais lenta do que a troca de protease catalisada 9 e atingiu o equilíbrio após apenas 48 dias. No entanto, a abordagem Aleo oferece a vantagem de etiquetagem peptídeos que não são reconhecidas por proteases. Além disso, os péptidos de incorporar múltiplos 18 átomos de O-, dependendo do número de cadeias laterais de ácidos, o que pode resultar na separação completa dos envelopes de isótopos de espécies não marcados e etiquetados. O deslocamento de massa global fornece informação sobre o número de resíduos de ácidos, em um dado péptido e a sua localização pode ser determinada por análise de mudanças de fragmentos de MS / MS de massa de iões. 18 O-rotulados peptídeos exibem comportamento cromatográfico próximo idêntica como os seus homólogos não marcados, que permite a sua análise comparativa no tempo de eluição idênticos. Em resumo, catalisada por ácido 18-O rótulo pode servir como uma alternativa à química, enrotulagem zymatic e metabólicas aproxima comumente utilizados em proteómica quantitativos. Uma aplicação particular desta técnica promissora é a utilização de péptidos de 18 O-rotulados como padrões de isótopos estáveis.

Figura 1
Figura 1. 18 rotulagem O-base oferece uma variedade de fluxos de trabalho do curso de tempo. (I) A protease catalisada fluxo de trabalho paleo-TimeCourse permite o acompanhamento da dinâmica de reações de clivagem proteolítica. Dependendo da protease, estes resultam reacções em (a) único (por exemplo, no caso de certos metaloproteases) ou (b) incorporação duplo 18 O-(por exemplo, no caso de certas proteases de serina). (II) O-Duplo 18 rotulador tal como a tripsina também podem ser usados ​​nos fluxos de trabalho de rotulagem postdigestion, em que 18 O-incorporação é unicamente mediada pela protease catalisadareacção de permuta de oxigénio carboxilo. (III) Em contraste, o fluxo de trabalho Aleo TimeCourse-depende das reacções catalisadas por ácido de oxigénio carboxilo câmbio de lado peptídeo ácido e grupos terminais. para ver figura maior .

Figura 2
Figura 2. Workflows experimentais dos paleo-e-Aleo TimeCourse estratégias. A) (I) Numa protease catalisada experimento Paleo TimeCourse, substratos são incubados com uma protease na presença de H 2 O 18, resultando na incorporação de até dois átomos de O-18, dependendo da protease. (II) Numa experiência de rotulagem postdigestion Paleo, produtos de clivagem a partir de uma digestão anterior, são re-incubadas com uma protease de interesse na presença de H 2 O. 18 Proteases capazes de dupla marcação (no fluxo de trabalho I) irá catalisar a incorporação de dois átomos de O-18. (III) Numa experiência Aleo catalisada por ácido, todos os grupos ácidos funcionais incorporar 18 átomos de O-B) Análise TimeCourse:.. Em intervalos de tempo, aliquotas das misturas de reacção são co-manchadas com matriz em MALDI-alvo placas Após MS- aquisição de dados, gráficos de tempo espectrais das reações de clivagem de peptídeos, bem como 18-O incorporação parcelas de espécies de peptídeos individuais são gerados e produtos de clivagem são selecionados para o MS / MS-identificação baseada em seqüência. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 3. Tramas de tempo espectrais exibir as dinâmicas das reacções de clivagem proteolitica. Traçando Os espectros de MS de Paleo-TimeCourse experiências num arranjo em cascata, é possível controlar simultaneamente a degradação do substrato e o aparecimento de produtos de clivagem intermédios e finais. Aqui, a clivagem do péptido bioactivo Endokinin C por enzima conversora de endotelina-1 (ECE-1) é mostrada. Produtos de clivagem foram identificadas por MS / MS e seus envelopes de isótopos mostrou as características 18 O incorporação de assinaturas (destacado em vermelho).

Figura 4
Figura 4. Serina-proteases tais como a tripsina mediar a incorporação de até dois átomos de O-18 em produtos de clivagem de péptidos. (I) trong> No fluxo de trabalho baseado em rotulagem de protease, o peptídeo de ligação resultados de clivagem de reação em uma única de 50% 18 razão O-incorporação para recém gerados produtos de clivagem de peptídeos (pontos pretos indicam não marcadas, vermelho único rotulados frações peptídicas). Proteases que REBIND seus produtos de reacção (por exemplo, proteases de serina, tais como tripsina) mais catalisar a incorporação de uma segunda via 18 O átomo de oxigénio do grupo carboxilo de reacção de troca (pontos verdes, duplamente marcada fracção peptídica). No equilíbrio, uma distribuição rótulo de 0.25:0.5:0.25. (Un; único; marcação dupla) é atingido (II) Na rotulagem postdigestion de fluxo de trabalho terminais proteolítica, há clivagens ligação peptídica ocorrer. Em vez disso, a incorporação de até dois átomos de O-18 baseia-se exclusivamente a reacção de permuta de oxigénio carboxilo. Portanto, 18 O-incorporação ocorre apenas com proteases que REBIND seus produtos de clivagem de péptidos.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.

Figura 5
Figura 5. Catalisada por ácido 18 O-rotulagem conduz à incorporação dos dois átomos de O-18 por grupo carboxilo. Ao longo da experiência, o envelope isotópica de angiotensina-1 foram submetidos a vários deslocamentos de massa 2 Da (linhas a tracejado) que correspondem à absorção de 18 de O-átomos. Os locais de 18 O-incorporação são realçados na sequência de aminoácidos (azul).

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Discussion

Através da combinação de rotulagem isótopo estável e de elevada resolução em espectrometria de massa de uma forma resolvida no tempo, o método Paleo TimeCourse-permite uma análise dinâmica da geração de produtos peptídicos. O ensaio pode ser utilizado para gerar péptidos marcados isotopicamente estáveis ​​para estudos quantitativos e qualitativos proteómica e avaliar a cinética através da qual os péptidos proteotypic são gerados. Além disso, Paleo TimeCourse foi concebido para avaliar as vias proteolíticas sob específico ex vivo, fisiologicamente relevante condições. Proteínas endógenas, péptidos e proteases, bem como peptídeos sintéticos e proteases recombinantes pode ser utilizado no fluxo de trabalho. Dependendo da reacção proteolítica específica a ser investigada, as condições de ensaio e os tempos de mancha pode ser ajustado para fornecer a amostragem óptima do processo de reacção. Em nossa experiência, é útil para retardar reações proteolíticas para baixo (por exemplo, usando baixas concentrações de enzimas, salatemperatura) para permitir intervalos de amostragem convenientes manual como com outras metodologias de isótopos estáveis ​​de rotulagem, os desvios para as 18 medições experimentais O ratio de incorporação são pequenas -. tipicamente menos de 5% para os picos com estatísticas suficientes de iões. O protocolo global pode ser facilmente adaptada a outros formatos de ensaio, por exemplo, o rastreio de um grande conjunto de substratos sintéticos ou a caracterização do processamento proteolítico de péptidos endógenos de amostras biológicas complexas (por exemplo, meios de cultura de células, fluidos corporais). Já foi previamente demonstrada como a abordagem paleo-podem ser hifenizadas com um passo de separação-LC, e utilizado para definir a composição dinâmica do peptidome salivar humana 9. Assinaturas proteolíticas identificados pelo Paleo-TimeCourse fornecer dados importantes sobre a especificidade do substrato da protease de interesse. Além disso, os dados em tempo resolvido também produz informação cinética. Tal conhecimento é particularmente útil na avaliação dos peptídeos proteotypic para estudos quantitativos proteómica, em que a escolha dos péptidos alvo altamente reprodutíveis e abundante é essencial 21. Do mesmo modo, a identificação de limitação de taxa etapas em vias proteolíticas é de grande interesse para o desenvolvimento de novos medicamentos à base de protease. Proteases são fatores-chave em muitos processos fisiológicos e patológicos (por exemplo, doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, câncer) e tais observações podem abrir novas oportunidades para intervenções terapêuticas. A estratégia Aleo - ácido catalisado por rotulagem de grupos carboxilo - é facilmente aplicado a péptidos sintéticos e endógena para produzir padrões estáveis ​​isotopicamente codificados. A cinética da reacção catalisada por ácido é muito mais lenta que a reacção enzimática catalisada. Portanto, os experimentos têm de ser cuidadosamente planejado com antecedência. Aleo-TimeCourse é uma alternativa de baixo custo para a química, metabólica e sintética rotulagem mÉTODOS atualmente utilizado em estudos de proteômica. O processo de marcação pode ser monitorada para validar que 18 O-incorporação atingido o equilíbrio, o que pode ser uma vantagem sobre os outros métodos de marcação de isótopos estáveis. Em conclusão, os fluxos de trabalho LeO TimeCourse-descritos aqui são ferramentas versáteis que podem ser empregadas de forma criativa em termos qualitativos e muitos estudos quantitativos proteômica, bem como pesquisa de protease.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PepClean C-18 Spin Columns Thermo 89870
Opti-TOF 384 MALDI target plate AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF/TOF AB SCIEX
Table 1. Materials
Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich 70990-1G-F
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A3294-10G
Dithiothreitol (DTT) Acros 16568-0050
Iodoacetamide (IAM) Sigma Aldrich 1149-5G
Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) R&D Systems 1784-ZN
Trypsin Gold Promega V5280
Water-18O, 97 atom % 18O Sigma Aldrich 329878-1G
Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo 28904
Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments AB SCIEX 4333604
Table 2. Reagents

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References

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Bioquímica Edição 72 Biologia Molecular Proteínas Proteômica Química Física MALDI-TOF espectrometria de massa proteômica proteólise quantificação rotulagem isótopo estável rotulagem catalisador peptídeos 18-O água enriquecida
Protease e catalisada por ácido Workflows Labeling Empregando<sup&gt; 18</sup&gt; O-enriquecido Água
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Klingler, D., Hardt, M. Protease-… More

Klingler, D., Hardt, M. Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water. J. Vis. Exp. (72), e3891, doi:10.3791/3891 (2013).

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