Summary
פרוטוקול וידאו זה מדגים את היישום של צבע carboxyfluorescein succinimidyl אסתר הניאון (CFSE) לזיהוי וההפרדה של תת אוכלוסיות שונות של תאים בגליובלסטומה האנושית המבוססות על תדר של חלוקת תא.
Abstract
ההטרוגניות גידול מייצגת תכונה מהותית תמיכת חוסן גידול ומהווה מכשול מרכזי לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות 1. כדי להתגבר על הבעיה של ההטרוגניות גידול, הוא חיוני לפיתוח מבחנים וכלים המאפשרים זיהוי פנוטיפית, (EPI) גנטי ופונקציונלי ואפיון של אוכלוסיות סרטניות המניעות פתולוגיות מחלות ספציפיות ומייצגים יעדים רלוונטיים קליני. עכשיו זה מבוסס היטב כי גידולי התערוכה ייחודיים משנה שברים של תאים עם תדרים שונים של חלוקת תא, וכי הקריטריונים התפקודיים של רכיבה איטית להיות קשורים באופן חיובי עם יכולת היווצרות גידול במספר סוגי סרטן, כוללים אלה של המוח, שד, העור ו לבלב כמו גם ללוקמיה 2-8. פלורסנט לצבוע carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) שמשה למעקב אחר חלוקת התדרים של תאים במבחנה ובחי בt דם נישאumors וגידולים מוצקים, כגון גליובלסטומה 2,7,8. פרו תרופת התא permeant הלא הניאון של CFSE מומרת על ידי esterases התאי לתוך מתחם ניאון, שנשמר בתוך תאים על ידי קוולנטית מחייבת לחלבונים באמצעות תגובה של מחצית succinimidyl עם קבוצות אמינות תאיות ליצור קשרים אמידים יציבים 9. הצבע הזרחני מופץ באופן שווה בין תאי בת על חטיבות, שמוביל את halving של עוצמת הקרינה בכל חלוקת תא. הדבר זה מאפשר מעקב של תדר מחזור התא עד 8-10 סיבובים של חטיבה 10. קיבולת אצירת CFSE שמשה עם תאים סרטניים במוח כדי לזהות ולבודד subpopulation רכיבה איטית (5% עליונים תאי צבע התמך-) הוכיח להיות מועשרים בפעילות תאי גזע הסרטן 2.
פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של הכתמת תאים עם CFSE והבידוד של אוכלוסיות בודדות בתוך תרבות של glio האנושיblastoma (GBM)-ליטול תאים בעלי שיעורי חלוקה שונה באמצעות cytometry הזרימה 2. הטכניקה משמשת כדי לזהות ולבודד אוכלוסיית רכיבה איטית גידול במוח של תאים בזכות היכולת שלהם לשמור על תיוג CFSE.
Protocol
1. הכנת השעית תא בודדה Glioblastoma
- תרבות Gliomasphere הוא הוקם ומתוחזק באמצעות assay neurosphere (NSA) כ2,11,12 תוארו קודם לכן.
- בזמן המתאים לpassaging את gliomaspheres, מדיום המכיל את תחומי מוסר, הונח בצינור מתאים גודל רקמת סטרילית תרבות, וcentrifuged ב 800 סל"ד (110 גר ') למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- Supernatant נמחק והגלולה של ספירות היא resuspended ב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA וטופחה על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 3-5 דקות.
- נפח שווה של מעכבי טריפסין סויה לאחר מכן נעשה שימוש כדי לעצור את פעילות טריפסין.
- השעית תא pipetted בעדינות מעלה ומטה כדי להבטיח אחידות ונטרול מוחלט של פעילות טריפסין.
- השעית התא היא centrifuged שוב ב800 סל"ד למשך 5 דקות. Supernatant מוסר ותאי resuspended ב1ml של NeuroCultבינוני אסאל המל"ל.
- 10μl של השעית התא בודד הוא מעורבב עם 90μl של trypan כחול לבצע ספירת תאים.
2. הכתמה עם תא Trace Carboxyfluorescein Succinimidyl גרין דיי פלורסנט אסתר (CFSE)
- עבור כל 1 מיליון תאים להיות מוכתם, 1 מ"ל של ריאגנט המכתים הוא הוכן על ידי הוספת μl 1 מתוך 5 מ"מ לצבוע סלולרי Trace CFSE (בדיקות מולקולריות, Invitrogen) ל1 מ"ל של מדיום אסאל NeuroCult המל"ל לתת ריכוז סופי מכתים של 5 מיקרומטר .
- מגיב מכתימה המכילים את התאים מתערבב היטב עד הומוגניות ודגר בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
- במהלך הדגירה, בינוני קר כקרח NeuroCult המל"ל אסאל מוכן כפתרון המרווה.
- כדי לעצור את תהליך הצביעה, כרכים כ 5-10 של פתרון מרווה קרה כקרח מתווספים לתאי CFSE הטעונים.
- אז הפתרון הוא centrifuged ב800 סל"ד למשך 5 דקות וsupernatant נמחק.
- ב הנקודה היא, לא אמור להופיע גלולה של תאים בחלק התחתון של הצינור עם גוון ירוק בוהק של צבע, המציין המכתים הייתה מוצלחת.
- התאים נשטפים על ידי resuspending גלול ב 1-2 מ"ל של מדיום טרי NeuroCult המל"ל אסאל, צנטריפוגה ב 800 סל"ד לדקות, והבריח את supernatant 5. הליך זה חוזר על עצמו עבור סכום כולל של שלוש כביסות.
- לאחר השטיפה השלישית, התאים resuspended ב 1 מ"ל של מדיום NeuroCult המל"ל אסאל וספירת תאים מתבצעת.
- תאי CFSE המוכתמים אז מצופים בצלוחיות תרבות רקמות סטריליים בצפיפות מתאימה [50,000 תאים / מ"ל] והניחו ב37 מעלות צלזיוס / 5% חממת humidified CO2.
3. אימות טוען CFSE
- תאים המצופים בתרבות NSA ניתן לנטר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאמת מכתים CFSE. בשלב זה, את כל התאים מפגינים צבע ירוק בהיר (איור 1). לחלופין, ירידה של השעית התא מתאים מוכתמים CFSE יכולים להיות ממוקמים בשקופית מיקרוסקופ ומכוסה בcoverslip כדי לחזות תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- תיוג CFSE מוצלח מאושר נוסף באמצעות cytometry זרימה. רבים כמו 1-5 x 10 5 תאים מכל קבוצה יספיקו לאימות מכתימה CFSE. CFSE נטען תאי תאי בקרה שליליים פרקו הם resuspended בהתאמה ב1 x-PBS או בינוני אסאל NeuroCult המל"ל להיקף כולל של 500 μl והניחו בצינורות FACS נפרדים.
- Cytometer הזרימה מותאם מתבסס על הוראות המדריך למשתמש שלה עבור פרמטרים קשורים. CFSE יש מקסימום עירור אורך גל של 492 ננומטר ומקסימום פליטה של 517 ננומטר.
- ראשית, תאי הבקרה פרקו מנוהלים והאירועים שנרכשו נרשמים בפיזור קדימה וצד (FSC לעומת SSC) וחלקות היסטוגרמה, והאוכלוסייה העיקרית היא התא מגודרת (איור 2 א).
- בדומה לכך, תאי CFSE הטעונים מנותחים באמצעות אותו הפרמטרשל תאים המשמש לבקרה (התרשים 2B).
4. בידוד של חלוקה איטית-[CFSE כלומר שימור] אוכלוסייה ניידת באמצעות מיון תא הופעל פלורסנט (FACS)
- לאחר החלוקה, עוצמת CFSE היא ירד ותאי hGBM יוצרים gliomaspheres שמורכבים מתאים מציגים רמות שונות של עוצמת קרינה ירוקה (איור 3). כאשר הגיע gliomaspheres גודל ממוצע של כ 150-200 מיקרומטר קוטר (כ 5 עד 10 ימי טעינת CFSE הודעה בהתאם לקצב גידול שורת התאים), המדיום המכיל את תחומי מוסר, הוצב בתרבית רקמה סטרילית מתאימה גודל צינור, וcentrifuged ב800 סל"ד למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- השעית תא בודד מוכנה כמתואר בשלבים קודמים ותאי resuspended ב PBS לספירת תאים על מנת להכין את השעית תא עם צפיפות של עד 10 7 תאים למ"ל.
- בירכתי הספינהאה resuspending התאים בנפח מתאים של PBS, יודיד Propidium (PI, סיגמא, 500 מיקרוגרם / מ"ל) הוא הוסיף בריכוז של μl 1 / מ"ל של השעית תא להוציא תאים מתים כאשר ממוין / נותח על ידי cytometry זרימה.
- שני צינורות 15 מ"ל סטריליים רקמות תרבות כל 1ml של מדיום המכיל מלא NeuroCult המל"ל משמשים לאיסוף תאים ממוינים מתחלקים איטי-(תאי התמך CFSE) והתאים המתחלקים מהר (תאי CFSE דילול).
- ראשית, השעית התא מקבוצת התא פרקה מנוהלת באמצעות cytometer הזרימה.
- התאים (אירועים) הם זממו מבוססים על פיזור (SSC) פיזור קדימה (FSC) לעומת צד ופרמטרי מתח עבור שני הפרמטרים מותאמים כך שרוב התאים כלולים בעלילת הזרימה.
- על מנת להוציא את התאים מתים או פגומים, התאים זממו מבוסס על תגובתיות SSC לעומת PI ואוכלוסיית התא החייה הבודדה (PI שלילי) היא מגודרת.
- ואז, אוכלוסיית תאים הומוגנית נבחרה על סמך fפיזור orward (FSC) לעומת פיזור צד (SSC).
- אז אוכלוסיית התאים הומוגנית האחת החיה זממה בהיסטוגרמה המבוססת על תדרים סלולריים לעומת עוצמת CFSE להגדיר בסולם לוגריתמים. עוצמת ליזר CFSE מותאמת על מנת למקם את האות השלילית בין 0 ל 100.
- שימוש באותם פרמטרים ואסטרטגית gating דומה, תאי CFSE הכותרת מופעלים באמצעות cytometer הזרימה ונתחו (4C איור).
- כתוצאה מכך, אוכלוסייה איטית חלוקה של תאים ואוכלוסייה כוללת (תאים המתחלקים מהר יותר) המזוהית מבוססת על היכולת שלהם לשמור על CFSE (CFSE 5% גבוהים ועליונים 85% CFSE נמוך תחתונים, בהתאמה).
- אוכלוסיות תאים שונים האלה אז מסודרות ל15 צינורות נפרדים מ"ל סטריליים רקמות תרבות המכילים 1ml של מדיום המל"ל להשלים.
- תאים ממוינים מכן centrifuged ב800 סל"ד למשך 5 דקות.
- Supernatant נמחק והגלול הוא resuspended בapproנפח priate של מדיום (תלוי במספר האירועים מבודדים או גודל כדורי) וספירת תאים מתבצע.
- תאים מהאוכלוסיות השונות הממוינות אז מצופים ב50,000 תאים למ"ל בבקבוקון התרבות מתאימה סטרילי רקמות והניחו ב37 מעלות צלזיוס / 5% CO2 חממת humidified עבור 5-10 ימים לפני שpassaged סדרתי או המשמש לניסויים במורד זרם.
5. נציג תוצאות
לאחר טעינת CFSE, כל התאים להציג פלואורסצנטי ירוקה אינטנסיבית כמו דמיינו תחת המיקרוסקופ (איור 1). צבע ירקרק ניתן לראות זאת גם בעין בלתי מזוינת (ראה וידאו). ניתוח תאים אלה עם cytometry הזרימה גם מראה פלואורסצנטי ירוק מאוד אינטנסיבי בהשוואה לתאי ביקורת (איור 2). עם התאים טעונים CFSE ציפוי בתרבות neurosphere, תאים אלה מתרבים ויוצרים 150-200 gliomaspheres מיקרומטר בתוך 5-10 ימים. כאשר התאים מתרבים, לא הוא צבע זרחני מופץ באופן שווה בין תאי בת על חטיבות, שמוביל את halving של עוצמת הקרינה בכל חלוקת תא. Glioblastomas פונקציונלי הוא הטרוגנית ומורכבת מתאים מתרבים על סולמות זמן שונים. השיטה שתוארה בפרוטוקול זה מאפשרת לזהות ולבודד תאים מהירים ואיטיים המתחלקים מכוח יכולתם לדלל או לשמור CFSE, בהתאמה (איור 3, גם לראות את הווידאו).
ניתוח cytometry זרימה של gliomaspheres ניתק שנוצר מהתאים CFSE טעונים בהשוואה לתאים פרקו מפגין תכונות שימור CFSE שונות (איור 4). תאים המתחלקים במהירות (85% למטה) או תאים המתחלקים איטיים (5% העליונים - CFSE הגבוהים) gliomapshere התערוכה יצרה יכולת כאשר בתרבית בתנאי assay neurosphere (איור 5).
1 gure "/>
איור 1. תאים סרטניים ניתקים מייד לאחר טעינה עם צבע CFSE. התאים מפגינים צבע ירוק בהיר מפגין תיוג מוצלח. גדלה מקורית, 10 x.
איור 2. אישור הטעינה CFSE באמצעות cytometry זרימה.) תאים נפרקו, ב) CFSE טעון תאים ו-C) השוואה בין עוצמת קרינת CFSE בתאים טעונים מול פרקו. שים לב שיש כמה סדרי גודל ההבדל בעוצמת הקרינה בין התאים שהכותרת וללא תווית.
איור 3. Gliomasphere נציג נגזר מתא CFSE טעון 6 ימים לאחר ציפוי. תאים מסוימים מפגינים מכתימים CFSE בהיר מאוד. הגדלה מקורית; 63 x.
איור 5. Gliomaspheres נציג שנוצר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר גדל והולך של מחקרים הוכיח את החשיבות של-תא תת איטי חלוקה-תאים בסרטן אשר תורמים להיווצרות גידול ועמידות לטיפול 2-8. לכן זה קריטי לתיאור ולתקנן שיטות ניסיוניות המאפשרות מחקר של תת אוכלוסיות ספציפיות זה של תאים או באופן כללי יותר להשוואת אוכלוסיות עם שיעורי צמיחה שונים. שימוש CFSE לזהות ולבודד משנה שברים של תאים בהתבסס על השיעור של חלוקת תא שלהם הוא נקודת התחלה כדי לקדם את אפיון השברים סלולריים ספציפיים האלה, מסייע לקדם את ההבנה של ההטרוגניות המתוארת בגידולינו. בפרוטוקול זה נתנו את הדוגמא של זיהוי ובידוד אוכלוסייה איטית חלוקה בתוך גליובלסטומה, אך פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על תאים סרטניים אחרים, כולל ולא מוגבלים לסרטן השד, לבלב ועור. ניתוח במורד זרם של אוכלוסיות אלה יכול להתבצע ויכול לכלול functמחקרי ional השוואת פוטנציאל שגשוג 2, יכולת גידול היווצרות 2, רגישות טיפול, ו( EPI) השוואות גנטיות. מתודולוגיה זו יכולה לשמש גם במערכות שאינן סרטניות ויכולה להיות מיושמת, למשל, לסומטי גזע / תאים מבשרים.
נקודות טכניות קריטיות בתוך ההליך מעורב ניתוק מספק של תאים עם טריפסין, וresuspension המספק של תאים בתקשורת המכתימה להקים צפיפות ראויה ולהבטיח צביעה אחידה. דגימה קטנה של תאים טריים מוכתמים צריכה להיבדק על ידי cytometry זרימה כדי להבטיח תיוג אחיד מתאפיין בפרופיל צר Gaussian דמוי (ראה איור 2B). במקרה של תיוג ראשוני הטרוגנית, טרום מיון ניתן לבצע על מנת לשפר את רזולוצית שיא עם טווח צר של קרינת CFSE. עם זאת, יש להבטיח כי מראש סוג זה אינו בוחר עבור גדלים ספציפיים. השימוש ביודיד propidium (PI) תיוג הוא אניmportant לזיהוי תאי חיים ומתה להסרה / פגום אוכלוסייה מהשער עובד, בשל ההטיה שתאים מתים יכולים להציג את היישומים במורד זרם. ראוי לציין עוצמת הקרינה הגבוהה במיוחד של תיוג CFSE והפוטנציאל שלה לדמם לאפיקים אחרים בעת שימוש fluorochromes שכנות בספקטרום, כגון fluorochrome phycoerythrin (PE). זה חיוני לציין שניסויי תיוג זמנית עם CFSE ונוגדנים fluorochrome-מצומדות עשויים לדרוש תהליך פיצוי בעת הרכישה או ניתוח. כדי להיות בטוח יש את כל הבקרות הנדרשות הכוללות תאי בתוליים (מתן רמת autofluorescence), תאים מוכתמים ביחידות ובשילוב הספציפי שלך. תיוג מרובה צבעים בשילוב עם CFSE עובד הכי טוב עם fluorochromes כגון פסיפיק בלו או Allophycocyanin (APC). אם מטרת הניסוי היא לכמת את המספר המוחלט של חלוקות תא במשך פרק זמן מוגדר, CFSE Mean עוצמת קרינה (MFI) יש למדוד במינימום הזמן שתי שונים מצביעה 2 עם לפחות 24 שעתי טעינת הודעת CFSE ראשון. עוצמת CFSE יורדת בצורה דרסטית במהלך 24 השעות הראשונות בהיעדר חלוקת תא, אך אז מתייצבת ופוחתת ביחס לחלוקת תא. זהו גם צורך לכלול שליטה בתאים טעונים CFSE הלא פרוליפרטיביות מספקים את הבסיס לדעיכת עוצמת CFSE לא קשורה לחלוקת תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מרכז פלורידה לחקר סרטן המוח, פרסטון א ולס ג'וניור המרכז לריפוי סרטן המוח והמכונים הלאומיים לבריאות (1R21CA141020-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
