Summary
이 비디오 프로토콜은 세포 분열의 주파수에 따라 인간 glioblastoma의 셀의 다른 하위 집단의 식별 및 분리를위한 형광 염료 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)의 응용 프로그램을 보여줍니다.
Abstract
종양 이질성은 종양 견고성을 지원하는 기본 기능을 나타냅니다 및 치료 전략 1의 발전에 중심 장애물를 제공합니다. 종양 이질성의 문제를 극복하려면, 특정 질병 pathologies을 유도하고 임상 적으로 관련성이 높은 목표를 대표하는 종양 subpopulations의 phenotypic (에피네프린) 유전 및 기능 식별 및 특성을 사용 assays과 도구를 개발하는 것이 필수적입니다. 그것은 지금은 잘 종양이 느린 자전거가되는 기능 기준을 적극적으로 종양이 형성 뇌, 유방, 피부를 포함한 여러 암의 능력과 연결되어 세포 분열의 다른 주파수로 세포의 하위 분수 독특한 전시입니다, 그리고 설립 췌장뿐만 아니라 백혈병 2-8. 형광 염료 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)이 혈액 관련 t의 체외에서 세포의 분열 주파수를 추적하고 생체에 사용되었습니다umors 및 glioblastoma 2,7,8 등의 고체 종양. CFSE의 세포 permeant 비 형광 프로 약물은 안정적인 아미드 결합 할 구를 형성하는 세포 아민 그룹과의 succinimidyl 잔기의 반응을 통해 단백질 covalently 구속력이 세포 내에서 유지되는 형광 화합물로 세포 esterases으로 변환됩니다. 형광 염료가 아침마다 세포 분열과 형광 강도의 반턱로 이어지는, 부서에 따라 딸 세포 사이에 분포되어있다. 이 부문 10 8-10 발까지 세포주기 주파수를 추적 할 수 있습니다. CFSE 유지 용량은 암 줄기 세포 활동 2 풍부 할 보여준 속도가 느린 자전거 subpopulation을 (위 5퍼센트 염료 유지 세포)를 식별하고 격리하는 뇌 종양 세포와 함께 사용되었습니다.
이 프로토콜은 인간 glio의 문화에서 CFSE로 세포를 얼룩의 기술과 개인 인구의 격리를 설명blastoma (GBM) - 파생 유동 세포 계측법 2를 사용 서로 다른 부문 가격을 가진 세포. 기술은 식별하고 CFSE 라벨을 유지하는 능력을 가진 세포의 뇌 종양이 천천히 자전거 인구를 분리하기 위해 제공하고 있습니다.
Protocol
1. Glioblastoma 단일 세포 현탁액을 준비
- Gliomasphere 문화는 설립 이전에 설명 2,11,12로 neurosphere 분석 (NSA)을 사용하여 유지됩니다.
- gliomaspheres을 passaging에 해당하는 시간에, 분야를 포함하는 매체는 적절한 크기 무균 조직 배양 관에 배치, 제거하고, 실온에서 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged.
- 표면에 뜨는는 삭제되고 영역의 펠렛은 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML에 resuspended 37의 ° C 3-5 분을위한 물 목욕에 incubated 수 있습니다.
- 콩 트립신 억제제의 동일한 볼륨은 다음 트립신의 활동을 중지하는 데 사용됩니다.
- 세포 현탁액은 부드럽게 동질성과 트립신의 활동을 완전히 중화을 보장하기 위해 아래로 pipetted하고 있습니다.
- 세포 현탁액 다시 5 분 800 rpm으로 centrifuged 있습니다. NeuroCult의 1ml에 표면에 뜨는이 제거되고 셀은 resuspended 아르NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간.
- 단일 셀 정지 10μl는 셀 카운트를 수행 할 trypan 블루의 90μl과 혼합되어 있습니다.
2. 셀 추적 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스터 (CFSE) 그린 형광 염료로 착색
- 스테인드 할 때마다 백만 세포를 들어, 염색 시약의 1 ML은 5 μm의 최종 착색 농도를 제공 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 보통 1 ML에 5 MM 셀 추적 CFSE 염색 (분자 프로브, Invitrogen) 1 μl를 추가하여 준비가되어 있습니다 .
- 세포를 포함하는 착색 시약은 동질성 때까지 잘 섞어 10 분 동안 실온에서 incubated입니다.
- 부화하는 동안, 얼음처럼 차가운 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 매체는 담금질 솔루션으로 준비가되어 있습니다.
- 염색 프로세스를 중지하려면 얼음처럼 차가운 담금질 솔루션의 약 5-10 권 CFSE -로드 셀에 추가됩니다.
- 솔루션은 다음 5 분 800 rpm으로 centrifuged되고 표면에 뜨는는 삭제됩니다.
- 일시요점은, 착색이 성공적 나타내는 색의 밝은 녹색 색조와 튜브의 하단에있는 세포 펠렛을가 나타납니다.
- 세포는 5 분 및 폐기 표면에 뜨는 800 rpm으로 centrifuging, 신선한 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 보통 1-2 ML에서 펠렛을 resuspending하여 세척합니다. 이 절차는 세 세차의 총 반복됩니다.
- 세 번째 세척 한 후 세포가 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간과 셀 수이 수행되는 1 ML에 resuspended 있습니다.
- CFSE 스테인드 세포는 다음 적절한 밀도 [50000 세포 / ML]에서 무균 조직 문화 플라스크에 도금 및 37 ° C / 5퍼센트 CO2 humidified 인큐베이터에 배치됩니다.
3. CFSE로드 확인
- NSA 문화에 도금 셀은 CFSE의 착색을 확인하기 위해 형광 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다. 이 단계에서, 세포의 모든 밝은 녹색 색상 (그림 1)을 나타냅니다. 의 세포 현탁액의 또는 드롭CFSE의 스테인드 세포는 현미경 슬라이드에 배치하고 형광 현미경으로 세포를 시각화하는 coverslip으로 덮여 될 수 있습니다.
- 성공적인 CFSE 라벨은 또한 유동 세포 계측법을 통해 확인된다. 각 그룹에서 많은 1-5으로 X 10 5 세포가 CFSE의 착색 확인을 위해 충분합니다. CFSE는 세포와 무부하 대조군 세포가 1 개 - PBS 500 μl의 총 볼륨에 대한 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간에 각각 resuspended와 별도의 FACS 튜브에 배치됩니다로드.
- 흐름 cytometer는 관련 매개 변수의 사용 설명서의 지침에 따라 조정됩니다. CFSE는 492 nm의와 517 nm의 방출 최대 파장 여기 최대가 있습니다.
- 첫째, 무부하 제어 세포가 실행되고 획득 이벤트 순방향 및 측면 분산 (FSC 대 SSC)와 히스토그램 플롯에 기록되며, 주요 세포 인구는 (그림 2A) 출입을 금지합니다.
- 마찬가지로, CFSE로드 셀은 동일한 매개 변수를 사용하여 분석s은 (는) 제어 세포 (그림 2B)에 사용됩니다.
4. 느린 - 분리 형광 활성 세포 정렬 (FACS)를 사용 세포 인구 [예 CFSE는 보관]을의 절연
- 부문시, CFSE 강도는 감소하고 hGBM 전지는 녹색 형광 강도의 다른 수준 (그림 3) 전시 세포로 구성되어 gliomaspheres를 형성하고 있습니다. gliomaspheres는 직경 약 150-200 μm (약 5-10일 세포주의 성장 속도에 따라 포스트 CFSE 로딩)의 평균 크기에 도달 한 경우, 영역을 포함하는 매체는 적절한 크기 무균 조직 배양에 배치, 제거 관, 그리고 실온에서 5 분 800 rpm으로 centrifuged.
- 이전 단계에서 설명하고 세포까지 밀리리터 당 10 7 셀 밀도와 세포 현탁액을 준비하기 위해 셀 수에 대한 PBS에 resuspended하기 때문에 단일 셀 정지이 준비되어 있습니다.
- 고물에응급실은 PBS의 적절한 볼륨에서 셀을 resuspending, Propidium의 요오드화물은 (PI, 시그마, 500 μg / ML) 1 μl / 정렬 / 유동 세포 계측법에 의해 분석하면 죽은 세포를 제외 세포 현탁액의 ML의 농도에 추가됩니다.
- 전체 NeuroCult NSC 매체의 각 포함 1ml 두 15 ML 멸균 조직 배양 튜브는 정렬 천천히 나누어 세포 (CFSE 유지 세포)와 빠른 나누어 세포를 (CFSE diluting 세포)를 수집하는 데 사용됩니다.
- 첫째, 무부하 셀 그룹에서 세포 현탁액은 흐름 cytometer를 통해 실행됩니다.
- 세포는 (이벤트) 세포의 대부분이 유동 계획에 포함되도록 조정됩니다 앞으로 분산 (FSC) 대 측 분산 (SSC)와 두 매개 변수에 대한 전압 매개 변수를 기반으로 꾸몄다됩니다.
- 죽었거나 손상된 세포를 제외하려면 셀 SSC 대 PI 반응성에 따라 해본와 하나의 라이브 세포 인구는 (PI 음수) 출입을 금지하고 있습니다.
- 그런 다음 단일 셀 인구는 F에 따라 선택됩니다orward 분산 (FSC) 대 측 분산 (SSC).
- 균일 한 라이브 세포 인구는 다음 로그 스케일에 자리 잡고 셀 주파수 대 CFSE 강도에 따라 막대 그래프에 도시된다. CFSE 레이저 강도는 0과 100 사이의 부정적인 신호를 배치하기 위해 조정됩니다.
- 동일한 매개 변수와 유사한 게이팅 전략을 사용하여 CFSE 표시된 셀은 흐름 cytometer를 통해 실행되며 (그림 4C) 분석했다.
- 그 후, 셀 및 전체 인구의 느린 나누어 인구는 (빠른 나누어 세포) CFSE을 (각각 CFSE 높은 상위 5 %와 CFSE 저 아래 85%), 유지하는 능력에 따라 식별됩니다.
- 이러한 서로 다른 세포 인구 그런 다음 전체 NSC 매체의 1ml를 포함하는 별도의 15 ML 멸균 조직 배양 튜브에 정렬됩니다.
- 정렬 셀은 다음 5 분 800 rpm으로 centrifuged 있습니다.
- appro에 표면에 뜨는는 삭제되고 펠릿은 resuspended 있습니다중간 (절연 행사 또는 펠릿 크기의 수에 따라)와 세포 수의 priate 볼륨이 수행됩니다.
- 다른 정렬 인구의 세포는 그 다음 적절한 무균 조직 배양 플라스크에 밀리리터 50,000 세포에서 도금 및 직렬 passaged 또는 하류 실험에 사용되기 전에 5~10일에 대해 37 ° C / 5퍼센트 CO2 humidified 인큐베이터에 배치됩니다.
5. 대표 결과
현미경 (그림 1)에서 시각화로 CFSE을로드 한 후, 모든 세포는 강렬한 녹색 형광을 제시한다. 이 녹색 착색 색상도 육안 (동영상 참조)와 함께 볼 수 있습니다. 유동 세포 계측법과 함께 세포를 분석하면 제어 세포 (그림 2)에 비해 매우 강렬한 녹색 형광을 보여줍니다. neurosphere 문화에 도금 CFSE로드 셀되면,이 세포는 세포 분열 따위에 의해 번식하고 5-10일에서 150-200 μm gliomaspheres를 형성하고 있습니다. 세포는 t를 분아 따위에 의해 중식으로 그는 형광 염료가 아침마다 세포 분열과 형광 강도의 반턱로 이어지는, 부서에 따라 딸 세포 사이에 분포되어있다. Glioblastomas는 기능적으로 이기종하고 다른 시간의 척도에 proliferating 세포로 구성되어 있습니다. 이 프로토콜에 설명 된 방법은 각각 CFSE을 희석하거나 유지하는 능력 (그림 3도 동영상을 참조)의 미덕에 의해 신속하고 느린 나누어 세포를 식별하고 분리 한 수 있습니다.
무부하 세포에 비해 CFSE -로드 셀에서 생성 dissociated gliomaspheres의 유동 세포 계측법 분석은 다양한 CFSE 보존 특성 (그림 4)을 보여줍니다. 빠른 나누어 세포 (아래 85 %) 또는 속도가 느린 나누어 전지 (상위 5 % - CFSE 높은) neurosphere 분석 조건 (그림 5)에서 배양하면 능력을 형성 전시 gliomapshere.
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그림 1. 즉시 CFSE 색소를로드 한 후 Dissociated 종양 세포. 세포 성공적으로 라벨을 보여주는 밝은 녹색 색상을 나타냅니다. 원래 배율, 10 ×.
그림 2. 유동 세포 계측법을 사용하여 CFSE 로딩 확인. A) 언로드 세포, B) CFSE는로드 대 무부하 셀에 CFSE 형광 강도를 비교) 세포와 C를로드. 라벨과 라벨이없는 세포 사이의 형광 강도의 크기 차이의 여러 명령이 있습니다.
그림 3. 육일 도금 후 CFSE -로드 셀에서 파생 된 대표 gliomasphere. 일부 셀은 매우 밝은 CFSE의 착색을 나타냅니다. 원래 배율, 63 X.
그림 4. 대표 유동 세포 계측법 플롯 / 육일 CFSE의 착색 후 빠르고 느린 나누어 세포의 분리에 대한 histograms. 죽었거나 손상된 세포를 제외 할 전체 세포 인구를 표시) FSC 대 SSC, B) SSC 대 PI 반응성, C) 게이트 FSC 대 SSC 동질적인 라이브 셀 인구, D는) 6 일 대조군에 비해 큰 형광 강도에 의해 입증으로 CFSE 라벨 후 CFSE 유지 세포의 존재를 보여줍니다. 히스토그램은 또한 CFSE 강도)이 시간. E를 통해 CFSE 유지 전지 (상위 5 %)와 CFSE diluting 세포 (하단 85 %)를 식별 할 수있는 게이팅 전략을 표시 히스토그램을 부패한 것으로 나타났습니다.
에서 생성 그림 5. 대표 gliomaspheres
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Discussion
연구의 증가는 종양 형성과 치료 저항 2-8에 기여하는 암의 세포의 느린 나누어 하위 칸의 중요성을 보여주고 있습니다. 따라서 서로 다른 성장 속도로 subpopulations을 비교하는 것이 더 일반적으로 세포 또는 특정 subpopulation의 연구를 가능하게 실험 방법을 설명하고 표준화하는 것이 중요합니다. 세포 분열 자신의 속도에 따라 세포의 하위 분수를 식별하고 분리 할 수 CFSE를 사용하면 종양에 설명 된 이질성의 우리의 이해를 향상하는 데 도움이 특정 세포 분수를 특성화 개선하기위한 출발점이 될 것입니다. 이 프로토콜에서 우리는 확인하고 glioblastoma에서 천천히 분리 인구를 분리의 예를 들어 줬어, 근데이 프로토콜은 포함하고 가슴, 췌장, 피부 암에 국한되지 않은 다른 종양 세포에도 적용 할 수 있습니다. 이러한 인구의 하류 분석을 수행 할 수 있으며, funct를 포함 할 수 있습니다proliferative 가능성이 2, 종양 형성 능력이, 치료 감도, 그리고 (에피네프린) 유전자 비교를 비교 ional 연구. 이 방법은 비 암 시스템과 함께 사용할 수 있으며, 체세포 줄기 / 전구 물질의 세포에, 예를 들어, 적용 할 수 있습니다.
프로 시저 내에서 중요한 기술 포인트는 적절한 밀도를 설정하고 균일 한 착색을 보장하는 트립신과 세포의 적절한 분리하고, 얼룩 미디어 세포의 충분한 resuspension을 참여. 갓 스테인드 세포의 작은 샘플은 가우스와 같은 좁은 프로파일 (그림 2B 참조)을 특징으로 동질적인 라벨을 보장하기 위해 유동 세포 계측법에 의해 확인해야합니다. 이기종 초기 라벨의 경우 사전 정렬이 CFSE의 형광 좁은 범위의 최대 해상도를 개선하기 위해 수행 할 수 있습니다. 그러나 그것은이 미리 정렬은 특정 크기를 선택하지 않는 것이 보장되어야한다. propidium의 요오드화물의 사용 (PI)이 라벨은 내가 있습니다라이브 세포를 식별 및 죽은 세포는 다운 스트림 응용 프로그램에서 소개 할 수있는 바이어스로 인해 작동 게이트에서 손상된 / 죽은 인구 제거에 대한 mportant. 이 같은 fluorochrome phycoerythrin (PE)으로 스펙트럼에 이웃 fluorochromes를 사용할 때 CFSE 라벨 및 기타 채널로 피하기위한 가능성의 특히 높은 형광 강도를 지적 가치가있다. 이 CFSE와 fluorochrome - 복합 항체와 다중 라벨 실험이 수집 또는 분석시 보상 과정을 필요로 할 수도 있습니다하는 매우 중요합니다. 흠없는 세포 (autofluorescence의 수준을 제공), 단독 스테인드 세포 및 특정 조합을 포함하는 모든 필요한 컨트롤을 가지고해야합니다. CFSE와 함께 여러 색상 라벨은 태평양 블루 또는 Allophycocyanin (APC) 등 fluorochromes와 함께 잘 작동됩니다. 실험의 목적은 시간의 정의 기간, CFS를 통해 전지 부문의 절대 수를 수량화하는 경우E는 형광 강도 (MFI) 두 개의 서로 다른 시간의 최소 측정하는 첫 번째 하나 이상 24 시간 후 CFSE 로딩으로 2 점을 의미합니다. CFSE 강도는 세포 분열의 부재에서 처음으로 24 시간 이내에 크게 떨어하지만 안정화와 세포 분열과 관련하여 줄어 듭니다. 또한 세포 분열과 관련없는 CFSE 강도 감소에 대한 기준을 제공하는 비 proliferative CFSE로드 셀과 컨트롤을 포함 할 필요가 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 뇌 종양 연구, 뇌 종양 치료 및 건강의 국립 연구소 (1R21CA141020-01)의 프레스턴 A. 웰스 주니어 센터 플로리다 센터에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
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