Summary
Este protocolo de video demuestra la aplicación de el colorante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para la identificación y separación de los diferentes sub-poblaciones de células de glioblastoma humano en base de la frecuencia de la división celular.
Abstract
Heterogeneidad tumoral representa una característica fundamental de apoyo robustez tumor y presenta un obstáculo fundamental para el desarrollo de estrategias terapéuticas 1. Para superar el problema de la heterogeneidad del tumor, es esencial para desarrollar ensayos y herramientas que permiten fenotípica, (epi) la identificación genética y funcional y la caracterización de las subpoblaciones tumorales que conducen a enfermedades y patologías específicas representan objetivos clínicamente relevantes. Actualmente está bien establecido que los tumores presentan distintas sub-fracciones de células con diferentes frecuencias de la división celular, y que los criterios funcionales de ser lento bicicleta está positivamente asociado con la capacidad de formación de tumores en varios tipos de cáncer, incluidos los del cerebro, mama, piel y páncreas, así como leucemia 2-8. El colorante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) se ha utilizado para el seguimiento de la frecuencia de división de las células in vitro e in vivo en transmisión sanguínea tumors y tumores sólidos tales como el glioblastoma 2,7,8. La célula-permeante no fluorescente pro-fármaco de la CFSE se convierte mediante esterasas intracelulares a un compuesto fluorescente, la cual es retenida dentro de las células por unión covalente a las proteínas mediante la reacción de su radical succinimidilo con grupos amina intracelulares para formar enlaces amídicos estables 9. El tinte fluorescente se distribuye por igual entre las células hijas a divisiones, llevando a la reducción a la mitad de la intensidad de la fluorescencia con cada división celular. Esto permite realizar un seguimiento de la frecuencia del ciclo celular hasta ocho a diez rondas de división 10. Capacidad de retención de CFSE se utilizó con las células tumorales del cerebro para identificar y aislar una subpoblación bicicleta lenta (parte superior 5% de retención de colorante células) demostraron ser enriquecido en actividad de células madre de cáncer 2.
Este protocolo describe la técnica de tinción de las células con CFSE y el aislamiento de las poblaciones individuales dentro de una cultura de humano glioblastoma (GBM)-derivados de células que poseen diferentes tipos de división usando citometría de flujo 2. La técnica ha servido para identificar y aislar un tumor cerebral lento bicicleta población de células en virtud de su capacidad para retener la CFSE etiquetado.
Protocol
1. Preparación de la suspensión Glioblastoma Single Cell
- Cultura Gliomasphere se establece y mantiene usando el ensayo de neurosphere (NSA) como se ha descrito previamente 2,11,12.
- En el momento apropiado para pasar las gliomaspheres, el medio que contiene las esferas se retira, se colocaron en un tubo estéril de tamaño apropiado de cultivo de tejidos, y se centrifugaron a 800 rpm (110 g) durante 5 min a temperatura ambiente.
- El sobrenadante se desechó y el sedimento de esferas se resuspendieron en 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA y se incubó a 37 ° C en un baño de agua durante 3-5 min.
- Un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se utiliza a continuación para detener la actividad de la tripsina.
- La suspensión de células se pipetearon suavemente hacia arriba y hacia abajo para asegurar la homogeneidad y la neutralización completa de la actividad de la tripsina.
- La suspensión celular se centrifugó de nuevo a 800 rpm durante 5 min. Se elimina el sobrenadante y se resuspendieron las células en 1 ml de NeuroCultNSC Basal Medium.
- 10μl de la suspensión de una sola célula se mezcla con 90μl de azul de tripano para realizar un recuento de células.
2. La tinción con célula de seguimiento Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) tinte verde fluorescente
- Por cada 1 millón de células a teñir, 1 ml de reactivo de tinción se prepara mediante la adición de 1 l de 5 mM célula tinte CFSE Trace (Molecular Probes, Invitrogen) a 1 ml de NeuroCult Medio Basal NSC para dar una concentración final de tinción de 5 micras .
- El reactivo de tinción que contiene las células se mezcla bien hasta homogeneidad y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min.
- Durante la incubación, enfriado con hielo NeuroCult Medio Basal NSC se prepara como la solución de enfriamiento.
- Para detener el proceso de tinción, aproximadamente 5-10 volúmenes de solución enfriamiento enfriado con hielo se añade a las células cargadas con CFSE.
- La solución se centrifuga a 800 rpm durante 5 min y el sobrenadante se desecha.
- En thes punto, debería aparecer un sedimento de células en la parte inferior del tubo con un tinte de color verde brillante de color, que indica la tinción fue exitosa.
- Las células se lavaron por resuspensión del sedimento en 1-2 ml de medio fresco NeuroCult NSC Basal, centrifugando a 800 rpm durante 5 min y desechar el sobrenadante. Este procedimiento se repite para un total de tres lavados.
- Después del tercer lavado, las células se resuspendieron en 1 ml de NeuroCult Medio Basal NSC y un recuento de células se realiza.
- Las células teñidas con CFSE se siembran en matraces estériles de cultivo de tejidos a una densidad apropiada [50.000 células / ml] y se colocó en un 37 ° C / 5% CO2 humidificado incubadora.
3. CFSE Verificación de Carga
- Células chapada en cultivo NSA se puede supervisar bajo un microscopio fluorescente para verificar la tinción CFSE. En esta etapa, todas las células presentan color verde brillante (Figura 1). Alternativamente, una gota de la suspensión de células a partir deCélulas CFSE manchadas podría ser colocado en un portaobjetos de microscopio y se cubrió con un cubreobjetos para visualizar las células bajo el microscopio de fluorescencia.
- CFSE etiquetado exitosa se ve confirmado por citometría de flujo. Tanto como 1-5 x 10 5 células de cada grupo es suficiente para la verificación CFSE tinción. El CFSE células cargadas y descargadas las células de control negativo se resuspendieron respectivamente en 1 x PBS-o NeuroCult Medio Basal NSC para un volumen total de 500 l y se colocaron en tubos FACS separados.
- El citómetro de flujo se ajusta basándose en las instrucciones del manual de usuario para los parámetros relacionados. CFSE tiene un máximo de excitación de longitud de onda de 492 nm y un máximo de emisión de 517 nm.
- En primer lugar, las células de control sin carga se ejecutan y los eventos adquiridos se registran en la dispersión frontal y lateral (FSC frente a SSC) y histogramas, y la población de células principal está cerrado (Figura 2A).
- Del mismo modo, las células cargadas con CFSE se analizaron usando el mismo parámetros utilizado para las células control (Figura 2B).
4. El aislamiento de la lenta dividiendo [CFSE es decir Retención] Población celulares utilizando Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
- Tras la división, la intensidad de CFSE se disminuyeron y las células hGBM formar gliomaspheres que se componen de células que muestran diferentes niveles de intensidad de fluorescencia verde (Figura 3). Cuando los gliomaspheres han alcanzado un tamaño medio de aproximadamente 150-200 micras de diámetro (aproximadamente de 5 a 10 días de carga CFSE mensaje en función de la tasa de crecimiento de células de línea), el medio que contiene las esferas se retira, se colocaron en un cultivo de tejido estéril tamaño apropiado tubo, y se centrifugó a 800 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
- Una única suspensión de células se prepararon como se describe en los pasos anteriores y las células se resuspendieron en PBS para un recuento de células con el fin de preparar una suspensión celular con una densidad de hasta 10 7 células por mililitro.
- En popaer resuspender las células en un volumen apropiado de PBS, yoduro de propidio (PI, Sigma, 500 mg / ml) se añade a una concentración de 1 l / ml de suspensión celular a excluir las células muertas cuando se ordenan / analizadas por citometría de flujo.
- Dos tubos estériles de 15 ml de cultivo de tejidos que contienen cada uno 1 ml de medio completo NeuroCult NSC se utiliza para recoger las células se dividen según lento (células CFSE retención) y las células que se dividen rápidamente las células CFSE (dilución).
- En primer lugar, la suspensión de células a partir del grupo de células carga y se ejecuta a través del citómetro de flujo.
- Las células (eventos) se trazan sobre la base de dispersión frontal (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) y los parámetros de voltaje para ambos parámetros se ajustan de modo que la mayoría de las células están incluidas en la trama de flujo.
- Para excluir las células muertas o dañadas, las células se trazan sobre la base de la reactividad frente a SSC PI y la única población de células vivas (PI negativo) es cerrada.
- Entonces, una población celular homogénea se selecciona basándose en forward dispersión (FSC) frente a dispersión lateral (SSC).
- La única población homogénea de células vivas se traza en un histograma basado en la frecuencia de células frente a la intensidad de CFSE establecido en una escala logarítmica. La intensidad del láser CFSE se ajusta con el fin de colocar la señal negativa entre 0 y 100.
- Usando los mismos parámetros y una estrategia de activación periódica similar, las células CFSE etiquetados se ejecutan a través del citómetro de flujo y se analizó (Figura 4C).
- Posteriormente, una población lento división de las células y la población en general (más rápido las células en división) se identifican basándose en su capacidad para retener CFSE (CFSE alto superior al 5% y CFSE bajo de fondo 85%, respectivamente).
- Estas poblaciones de células diferentes se clasifican en distintas 15 ml tubos estériles de cultivo de tejidos que contienen 1 ml de medio completo NSC.
- Las células clasificadas se centrifugan a 800 rpm durante 5 min.
- El sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió está en una aprovolumen de medio de apropiados (en función del número de eventos aislados o tamaño de los gránulos) y un recuento de células se lleva a cabo.
- Las células de las diferentes poblaciones según luego se sembraron en placas a 50.000 células por mililitro en un matraz estéril apropiado de cultivo de tejido y se colocan en un 37 ° C / 5% CO2 humidificado incubadora durante 5-10 días antes de que se pasa en serie o utilizados para experimentos posteriores.
5. Los resultados representativos
Después de la carga CFSE, todas las células presentan una fluorescencia de color verde intenso como se visualizaron bajo el microscopio (Figura 1). Este color verde-teñido se puede ver incluso con el ojo desnudo (ver el video). Analizando estas células con citometría de flujo también muestra la fluorescencia de color verde muy intenso en comparación con las células control (Figura 2). Una vez cargadas las células CFSE enchapado en cultivo neurosphere, estas células proliferan y forman 150-200 micras gliomaspheres en 5-10 días. Como las células proliferan, t colorante fluorescente que se distribuye por igual entre las células hijas a divisiones, llevando a la reducción a la mitad de la intensidad de la fluorescencia con cada división celular. Los glioblastomas son funcionalmente heterogéneo y se componen de células que proliferan en escalas de tiempo diferentes. El método descrito en este protocolo permite identificar y aislar las células en división rápida y lenta en virtud de su capacidad de diluir o retener CFSE, respectivamente (Figura 3, también ver el video).
Análisis de citometría de flujo de gliomaspheres disociadas generados a partir de células cargadas con CFSE en comparación con las células sin carga se muestra diversas propiedades de retención de CFSE (Figura 4). Fast células en división (inferior al 85%) o lentas las células en división (el 5% - CFSE bajo) gliomapshere exhibición capacidad de formación cuando se cultivan en las condiciones del ensayo neurosphere (Figura 5).
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Figura 1. Las células disociadas tumorales inmediatamente después de la carga con el colorante CFSE. Las células presentan color verde brillante demostración de etiquetado éxito. Aumento original; 10 x.
Figura 2. Confirmación CFSE carga usando citometría de flujo. A) células sin carga, B) CFSE cargado células y c) comparar la intensidad de fluorescencia de CFSE en las células cargadas frente descargada. Tenga en cuenta que hay varios órdenes de magnitud de diferencia en la intensidad de fluorescencia entre las células marcadas y no marcadas.
Figura 3. Un representante gliomasphere derivada de una célula CFSE-cargado 6 días después de la siembra. Algunas células exhiben tinción CFSE muy brillante. Aumento original, 63 x.
Figura 4. Representante de citometría de flujo parcelas / histogramas para el aislamiento de las células en división rápida y lenta de 6 días después de la tinción con CFSE. Una reactividad) FSC frente a SSC para mostrar toda la población celular, B) vs SSC PI para excluir las células muertas o dañadas, C) FSC frente a SSC para puerta de una población homogénea de células vivas, D) demuestra la presencia de células CFSE retención 6 días después de CFSE etiquetado como se evidencia por una mayor intensidad de fluorescencia en comparación con el control negativo. El histograma también muestra que la intensidad de CFSE decayó con el tiempo. E) Histograma que muestra la estrategia de activación periódica para identificar células CFSE retención (superior al 5%) y las células CFSE de dilución (85% inferior).
Figura 5. Gliomaspheres representativos generados a partir de
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Discussion
Un creciente número de estudios han demostrado la importancia de una lenta dividiendo sub-compartimiento de células en el cáncer que contribuyen a la formación de tumores y la resistencia al tratamiento 2-8. Por lo tanto es crítico para describir y estandarizar los métodos experimentales que permiten el estudio de esta subpoblación específica de células o de manera más general para comparar las subpoblaciones con diferentes tasas de crecimiento. Usando CFSE para identificar y aislar sub-fracciones de las células en función de su tasa de división celular es un punto de partida para promover la caracterización de estas fracciones celulares específicos, ayudando a mejorar nuestra comprensión de la heterogeneidad descrita en los tumores. En este protocolo se dio el ejemplo de la identificación y el aislamiento de una población de lento divisoria dentro glioblastoma, pero este protocolo también se puede aplicar a otras células tumorales, incluyendo y sin limitarse a los cánceres de mama, páncreas y piel. Análisis de aguas abajo de estas poblaciones se puede realizar y pueden incluir funcLos estudios que comparan ional potencial proliferativo 2, la capacidad de formación de tumores 2, la sensibilidad de tratamiento, y (epi) comparaciones genéticas. Esta metodología también se puede utilizar con sistemas no cancerosas y se puede aplicar, por ejemplo, a la madre somáticas / células precursoras.
Puntos críticos técnicas en el procedimiento implicaba la disociación adecuada de las células con tripsina, y resuspensión suficiente de células en los medios de tinción para establecer una densidad apropiada y asegurar la tinción homogénea. Una pequeña muestra de recién células teñidas deben ser revisados por citometría de flujo para garantizar el etiquetado homogéneo caracterizado por un perfil gausiano estrecho-like (ver Figura 2B). En el caso de etiquetado inicial heterogénea, una pre-ordenación se puede realizar con el fin de mejorar la resolución de los picos con más estrecho rango de fluorescencia CFSE. Sin embargo, hay que asegurarse de que esta pre-ordenar no selecciona para tamaños específicos. El uso de yoduro de propidio (PI) i es etiquetadomportante para la identificación de células vivas y para la eliminación de población muerto / dañado de la puerta de trabajo, debido a los prejuicios que las células muertas se pueden introducir en las aplicaciones posteriores. Vale la pena observar la intensidad de fluorescencia particularmente alto de la CFSE etiquetado y su potencial para sangrar en otros canales utilizando fluorocromos vecinos en el espectro, tales como la ficoeritrina fluorocromo (PE). Es fundamental señalar que los experimentos con CFSE etiquetado multiplex y los anticuerpos conjugados con fluorocromo puede requerir un proceso de indemnización en el momento de adquisición o análisis. Asegúrese de tener todos los controles necesarios, que incluyen las células teñidas (proporcionando el nivel de autofluorescencia), solos células de colores y su combinación específica. De color múltiple etiquetado en combinación con CFSE funciona mejor con fluorocromos tales como Pacific Blue o aloficocianina (APC). Si el propósito del experimento es el de cuantificar el número absoluto de divisiones celulares durante un periodo de tiempo definido, el CFSE intensidad de fluorescencia media (MFI) tiene que ser medida en un mínimo de dos diferentes puntos de tiempo 2 con la primera por lo menos 24 horas después de la carga de CFSE. CFSE intensidad cae drásticamente en las primeras 24 horas en ausencia de la división celular, pero luego se estabiliza y disminuye en relación con la división celular. También es necesario incluir un control con células CFSE no proliferativas cargadas que proporcionan la línea de base para la desintegración CFSE intensidad no relacionadas con la división celular.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Centro de la Florida para la Investigación del tumor cerebral, el Preston A. Wells Jr. Centro de Terapia del tumor cerebral y los Institutos Nacionales de Salud (1R21CA141020-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
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