Summary
इस वीडियो प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट डाई carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) की पहचान और मानव glioblastoma में कोशिकाओं के विभिन्न उप आबादी कोशिका विभाजन की आवृत्ति के आधार पर अलग होने के लिए आवेदन को दर्शाता है.
Protocol
1. Glioblastoma एकल कक्ष निलंबन की तैयारी
- Gliomasphere संस्कृति की स्थापना की है और 2,11,12 पहले से वर्णित neurosphere परख (एनएसए) का उपयोग कर बनाए रखा.
- Passaging gliomaspheres के लिए उपयुक्त समय क्षेत्रों से युक्त मध्यम हटा दिया है, एक उचित आकार बाँझ टिशू कल्चर ट्यूब में रखा है, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 rpm (110 ग्राम) पर centrifuged.
- तैरनेवाला त्याग और क्षेत्रों के गोली 0.05% trypsin - EDTA के 1 मिलीलीटर में resuspended है और 37 डिग्री पर 3-5 मिनट के लिए पानी में स्नान सी incubated.
- सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा तो trypsin गतिविधि को रोकने के लिए किया जाता है.
- सेल निलंबन धीरे से ऊपर pipetted है और नीचे एकरूपता और trypsin गतिविधि की पूरी निराकरण सुनिश्चित.
- सेल निलंबन फिर 5 मिनट के लिए 800 rpm पर centrifuged है. तैरनेवाला हटा दिया है और NeuroCult की 1ml में कोशिकाओं resuspendedएनएससी बेसल मध्यम.
- निलंबन एकल कोशिका के 10μl 90μl trypan नीले रंग की एक कोशिका गिनती करने के साथ मिलाया जाता है.
2. सेल ट्रेस Carboxyfluorescein Succinimidyl एस्टर (CFSE) हरी फ्लोरोसेंट रंजक के साथ धुंधला हो जाना
- हर 1 मिलियन कोशिकाओं के लिए दाग होना, धुंधला अभिकर्मक के 1 मिलीग्राम के 1 मिलीग्राम NeuroCult एनएससी बेसल मध्यम 5 मिमी सेल ट्रेस CFSE डाई (आण्विक जांच, Invitrogen) के 1 μl जोड़ने के लिए 5 सुक्ष्ममापी की एक अंतिम धुंधला हो जाना एकाग्रता दे द्वारा तैयार की है .
- धुंधला हो जाना कोशिकाओं से युक्त अभिकर्मक एकरूपता जब तक अच्छी तरह मिलाया जाता है और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated.
- ऊष्मायन के दौरान, बहुत ठंडा NeuroCult एनएससी बेसल मध्यम शमन समाधान के रूप में तैयार किया जाता है.
- धुंधला प्रक्रिया को रोकने के लिए, बर्फ ठंड शमन समाधान के लगभग 5-10 मात्रा CFSE भरी हुई कोशिकाओं को जोड़ा जाता है.
- समाधान तो 5 मिनट के लिए 800 rpm पर centrifuged और तैरनेवाला खारिज कर दिया है.
- वें से कमबिंदु है, वहाँ चमकीले हरे रंग की एक टिंट के साथ कोशिकाओं के ट्यूब के नीचे एक गोली, प्रकट चाहिए दर्शाता है धुंधला हो जाना सफल रहा था.
- कोशिकाओं ताजा NeuroCult एनएससी बेसल मध्यम 1-2 मिलीलीटर में गोली resuspending, 5 मिनट और discarding तैरनेवाला के लिए 800 rpm पर centrifuging से धोया जाता है. यह प्रक्रिया तीन washes के एक कुल के लिए दोहराया है.
- 3 धोने के बाद, कोशिकाओं NeuroCult एनएससी बेसल मध्यम और एक कोशिका गिनती प्रदर्शन है 1 मिलीलीटर में resuspended कर रहे हैं.
- CFSE दाग कोशिकाओं तो एक उपयुक्त घनत्व [50,000 कोशिकाओं / एमएल] बाँझ टिशू कल्चर बोतल में चढ़ाया और एक 37 ° / सी 5% CO2 humidified इनक्यूबेटर में रखा गया है.
3. CFSE लोड हो रहा सत्यापन
- एनएसए संस्कृति में चढ़ाया सेल एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे CFSE धुंधला हो सत्यापित नजर रखी जा सकती है. इस स्तर पर, कोशिकाओं के सभी प्रदर्शन चमकीले हरे रंग (1 चित्रा). वैकल्पिक रूप से, सेल निलंबन की एक से ड्रॉपएक खुर्दबीन स्लाइड पर CFSE दाग कोशिकाओं रखा जा सकता है और एक coverslip के साथ कवर करने के लिए फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं कल्पना.
- सफल CFSE लेबलिंग आगे प्रवाह cytometry के माध्यम से इसकी पुष्टि की है. के रूप में कई के रूप में 1-5 x 10 प्रत्येक समूह से 5 कोशिकाओं CFSE धुंधला हो सत्यापन के लिए पर्याप्त है. भरा हुआ CFSE कोशिकाओं और उतार नकारात्मक नियंत्रण कक्ष क्रमशः 1 x 500 μl की कुल मात्रा के लिए पीबीएस या NeuroCult एनएससी बेसल मध्यम में resuspended हैं और अलग FACS ट्यूबों में रखा.
- प्रवाह cytometer संबंधित मानकों के लिए अपने उपयोगकर्ता पुस्तिका के निर्देश के आधार पर निकाला जाता है. CFSE 492 एनएम और 517 एनएम के अधिकतम उत्सर्जन की एक तरंग दैर्ध्य उत्तेजना अधिकतम है.
- सबसे पहले, उतार नियंत्रण कक्ष चला रहे हैं और हासिल कर ली घटनाओं आगे और साइड (FSC बनाम एसएससी) तितर बितर और हिस्टोग्राम भूखंडों में दर्ज कर रहे हैं, और मुख्य सेल आबादी gated (2A चित्रा).
- इसी तरह, CFSE लोड कोशिकाओं को एक ही पैरामीटर का विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैंएस नियंत्रण कक्ष (चित्रा 2B) के लिए इस्तेमाल किया.
4. धीमी गति से विभाजित सेल आबादी [यानी CFSE बनाए रखने] प्रतिदीप्त सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करने का अलगाव
- विभाजन पर, CFSE तीव्रता कम है और hGBM कोशिकाओं gliomaspheres कि हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता के विभिन्न स्तरों (3 चित्रा) का प्रदर्शन कोशिकाओं से बना रहे हैं के रूप में. जब gliomaspheres व्यास में लगभग 150-200 मीटर (लगभग 5 से 10 दिनों के बाद CFSE कोशिका लाइन विकास दर पर निर्भर करता है लोड हो रहा है) की एक औसत आकार तक पहुँच चुके हैं, क्षेत्रों युक्त मध्यम निकाल दिया है, एक उचित आकार बाँझ टिशू कल्चर में रखा ट्यूब, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 rpm पर centrifuged.
- एक एकल कोशिका निलंबन के रूप में पूर्व चरणों में वर्णित है और कोशिकाओं पीबीएस में एक सेल गिनती के लिए resuspended क्रम में एक मिली लीटर प्रति 10 7 कोशिकाओं को घनत्व के साथ एक सेल निलंबन तैयार के लिए तैयार है.
- पिछाड़ीएर पीबीएस के एक उचित मात्रा में कोशिकाओं resuspending, Propidium आयोडाइड (पीआई, सिग्मा, 500 छ / मिलीलीटर) 1 μl / सेल निलंबन की मृत कोशिकाओं को बाहर जब क्रमबद्ध / प्रवाह cytometry से विश्लेषण मिलीलीटर की एक एकाग्रता में जोड़ा जाता है.
- दो 15 मिलीलीटर बाँझ टिशू कल्चर ट्यूबों पूरा NeuroCult एनएससी मध्यम के प्रत्येक युक्त 1ml क्रमबद्ध धीमी गति से विभाजित कोशिकाओं (CFSE कोशिकाओं को बनाए रखना है) और तेजी से कोशिकाओं को विभाजित (CFSE गिराए कोशिकाओं) को इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- सबसे पहले, उतार सेल समूह से सेल निलंबन प्रवाह cytometer के माध्यम से चलाया जाता है.
- कोशिकाओं (घटनाओं) आगे तितर बितर (FSC) बनाम पक्ष तितर बितर (एसएससी) और दोनों मापदंडों के लिए वोल्टेज मानकों के आधार पर प्लॉट किए जाते हैं इतना समायोजित कर रहे हैं कि कोशिकाओं के बहुमत के प्रवाह की साजिश में शामिल कर रहे हैं.
- मृत या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को बाहर करने के लिए, सेल एसएससी बनाम PI जेट पर आधारित है प्लॉट किए जाते हैं और एक जीवित कोशिका जनसंख्या (नकारात्मक पीआई) gated है.
- फिर, एक सजातीय सेल आबादी च के आधार पर चुना जाता हैorward (FSC) तितर बितर बनाम ओर तितर बितर (एसएससी).
- सजातीय एक जीवित कोशिका आबादी तो एक सेल आवृत्ति बनाम CFSE तीव्रता एक लघुगणकीय पैमाने पर सेट पर आधारित हिस्टोग्राम में साजिश रची है. के क्रम में 0 और 100 के बीच नकारात्मक संकेत जगह CFSE लेजर की तीव्रता समायोजित किया जाता है.
- एक ही पैरामीटर और एक समान gating रणनीति का प्रयोग, CFSE लेबल की कोशिकाओं प्रवाह cytometer के माध्यम से चलाए जा रहे हैं और विश्लेषण (चित्रा 4C).
- बाद में, कोशिकाओं और एक समग्र जनसंख्या की एक धीमी विभाजन जनसंख्या (तेजी से विभाजित कोशिकाओं) अपने (उच्च शीर्ष CFSE 5% और कम नीचे CFSE 85%, क्रमशः) CFSE बनाए रखने की क्षमता पर आधारित पहचान कर रहे हैं.
- ये अलग सेल आबादी तो अलग 15 मिलीलीटर बाँझ टिशू कल्चर पूरा एनएससी माध्यम के 1ml युक्त ट्यूबों में हल कर रहे हैं.
- के आधार पर छाँटे गए कोशिकाओं को फिर 5 मिनट के लिए 800 rpm पर centrifuged कर रहे हैं.
- तैरनेवाला खारिज कर दिया है और एक appro में गोली resuspended हैमध्यम (अलग घटनाओं या गोली आकार की संख्या पर निर्भर करता है) और एक कोशिका गिनती priate मात्रा प्रदर्शन किया है.
- विभिन्न आबादी से क्रमबद्ध कोशिकाओं तो एक उपयुक्त बाँझ टिशू कल्चर फ्लास्क में मिली लीटर प्रति 50,000 कोशिकाओं पर चढ़ाया और serially passaged या बहाव के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया से पहले 5-10 दिनों के लिए एक 37 ° / सी 5% CO2 humidified इनक्यूबेटर में रखा.
5. प्रतिनिधि परिणाम
लदान के बाद CFSE, सभी कोशिकाओं को एक तीव्र हरी प्रतिदीप्ति वर्तमान के रूप में माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के तहत visualized. यह हरे रंग रंगा हुआ नग्न आंख (वीडियो देखें) के साथ भी देखा जा सकता है. प्रवाह cytometry के साथ इन कोशिकाओं का विश्लेषण भी नियंत्रण कक्ष (2 चित्रा) की तुलना में अत्यधिक तीव्र हरी प्रतिदीप्ति से पता चलता है. चढ़ाना neurosphere संस्कृति में CFSE कोशिकाओं पर लोड, इन कोशिकाओं को पैदा करना और 5-10 दिनों में 150-200 सुक्ष्ममापी gliomaspheres फार्म. के रूप में कोशिकाओं पैदा करना, टी वह फ्लोरोसेंट रंजक डिवीजनों पर समान रूप से बेटी की कोशिकाओं के बीच वितरित की, हर कोशिका विभाजन के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता के संयोग के लिए अग्रणी. Glioblastomas कार्यात्मक विषम हैं और अलग अलग समय के तराजू पर proliferating कोशिकाओं से बना है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि एक करने के लिए सक्षम बनाता है की पहचान करने और अपने को पतला या CFSE बनाए रखने के लिए, क्रमशः क्षमता (3 चित्रा, वीडियो भी देखें) के पुण्य से तेज और धीमी गति से विभाजित कोशिकाओं को अलग.
प्रवाह cytometry विश्लेषण अलग उतार कोशिकाओं की तुलना में CFSE लोड कोशिकाओं से उत्पन्न gliomaspheres के विविध CFSE प्रतिधारण गुण (4 चित्रा) को दर्शाता है. तेजी से विभाजित कोशिकाओं (85%) नीचे या धीमी गति से विभाजित कोशिकाओं (शीर्ष 5% - उच्च CFSE) प्रदर्शनी करने की क्षमता बनाने जब में neurosphere परख शर्तों (5 चित्रा) सुसंस्कृत gliomapshere.
1 gure "/>
चित्रा 1 CFSE डाई के साथ लोड करने के बाद तुरंत dissociated ट्यूमर कोशिकाओं. कोशिकाओं चमकीले हरे सफल लेबलिंग प्रदर्शन रंग दिखा रहे हैं. मूल बढ़ाई, 10 x.
चित्रा 2 CFSE लोड हो रहा है प्रवाह cytometry का उपयोग कर पुष्टि.) CFSE उतार कोशिकाओं बी) कोशिकाओं और सी लोड) लोड बनाम उतार कोशिकाओं CFSE प्रतिदीप्ति तीव्रता तुलना. ध्यान दें कि वहाँ लेबल और unlabeled कोशिकाओं के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर परिमाण के कई आदेशों है.
चित्रा 3. एक प्रतिनिधि चढ़ाना के बाद 6 दिनों से भरी हुई एक सेल CFSE से व्युत्पन्न gliomasphere. कुछ कक्षों में प्रदर्शन बहुत उज्ज्वल CFSE धुंधला हो. मूल बढ़ाई, 63 x.
चित्रा 5. प्रतिनिधि से उत्पन्न gliomaspheres
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
पढ़ाई की बढ़ती संख्या एक धीमी गति से विभाजित कैंसर में कोशिकाओं जो ट्यूमर गठन और उपचार 2-8 प्रतिरोध योगदान की उप डिब्बे के महत्व का प्रदर्शन किया है. इसलिए यह वर्णन करने के लिए और प्रयोगात्मक कोशिकाओं या अधिक आम तौर पर इस विशिष्ट subpopulation के अध्ययन को सक्षम करने के लिए विभिन्न विकास दर के साथ subpopulations की तुलना तरीकों मानकीकरण के लिए महत्वपूर्ण है. CFSE का उपयोग करने के लिए पहचान करने और उनके कोशिका विभाजन की दर के आधार पर कोशिकाओं के उप fractions को अलग करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के इन विशिष्ट सेलुलर fractions निस्र्पक, ट्यूमर में वर्णित विविधता के बारे में हमारी समझ अग्रिम की मदद करने आगे है. इस प्रोटोकॉल में हम पहचान और glioblastoma भीतर एक धीमी गति से विभाजित आबादी अलग उदाहरण दिया था, लेकिन इस प्रोटोकॉल भी अन्य ट्यूमर कोशिकाओं, सहित और स्तन अग्नाशय, और त्वचा कैंसर के लिए सीमित नहीं करने के लिए लागू किया जा सकता है. इन आबादियों के बहाव विश्लेषण किया जा सकता है और funct शामिल कर सकते हैंional proliferative संभावित 2, ट्यूमर गठन करने की क्षमता 2, उपचार संवेदनशीलता, और (ईपीआई) आनुवंशिक तुलना की तुलना अध्ययन. इस पद्धति भी गैर कैंसर प्रणालियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है और, उदाहरण के लिए लागू किया जा सकता है दैहिक स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं, जा.
प्रक्रिया में महत्वपूर्ण तकनीकी अंक trypsin के साथ कोशिकाओं के पर्याप्त पृथक्करण, और धुंधला मीडिया में कोशिकाओं की पर्याप्त resuspension के लिए एक उचित घनत्व स्थापित और समरूप धुंधला हो जाना सुनिश्चित करने के शामिल किया गया. प्रवाह cytometry द्वारा हौसले दाग कोशिकाओं का एक छोटा सा नमूना जाँच की जानी चाहिए समरूप एक गाऊसी जैसे संकीर्ण प्रोफ़ाइल (चित्रा 2B देखें) विशेषता लेबलिंग सुनिश्चित. विषम प्रारंभिक लेबलिंग के मामले में, एक पूर्व सॉर्ट क्रम में CFSE प्रतिदीप्ति परिमित सीमा के साथ शिखर संकल्प में सुधार किया जा सकता है. लेकिन यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि इस पूर्व तरह विशिष्ट आकार के लिए चयन नहीं करता है. propidium आयोडाइड का उपयोग (पीआई) लेबलिंग मैं हैजीवित कोशिकाओं की पहचान के लिए और मृत / क्षतिग्रस्त काम गेट से आबादी हटाने, पूर्वाग्रह है कि मृत कोशिकाओं बहाव के अनुप्रयोगों में लागू कर सकते हैं के कारण के लिए mportant. यह जब ऐसे द्वारा fluorochrome phycoerythrin (पीई) के रूप में स्पेक्ट्रम, में fluorochromes पड़ोसी का उपयोग विशेष रूप से उच्च CFSE लेबलिंग और इसके संभावित अन्य चैनलों में खून के प्रतिदीप्ति तीव्रता टिप्पण लायक है. यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि मल्टीप्लेक्स CFSE और fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग प्रयोगों अधिग्रहण या विश्लेषण के समय में एक मुआवजा प्रक्रिया की आवश्यकता हो सकती है. सभी आवश्यक नियंत्रण है कि अस्थिर कोशिकाओं (autofluorescence के स्तर प्रदान), अकेले दाग कोशिकाओं और अपने विशिष्ट संयोजन सुनिश्चित रहो. कई रंग संयोजन में CFSE साथ लेबलिंग प्रशांत ब्लू या Allophycocyanin (APC) के रूप में fluorochromes के साथ सबसे अच्छा काम करता है. यदि प्रयोग का उद्देश्य समय का एक निर्धारित अवधि, सीएफएस पर कोशिका विभाजन की निरपेक्ष संख्या योंई प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) के लिए दो अलग अलग समय की एक न्यूनतम पर मापा जा सकता है 1 एक साथ कम से कम 24 घंटे बाद CFSE loading 2 अंक मतलब. CFSE तीव्रता कोशिका विभाजन के अभाव में पहले 24 घंटे के भीतर तेजी से चला जाता है, लेकिन फिर स्थिर और कोशिका विभाजन के संबंध में कम हो जाती है. यह भी गैर proliferative CFSE लोड कोशिकाओं कोशिका विभाजन के लिए संबंधित नहीं CFSE तीव्रता क्षय के लिए आधारभूत प्रदान करने के साथ एक नियंत्रण को शामिल करने के लिए आवश्यक है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के ब्रेन ट्यूमर अनुसंधान, प्रेस्टन ए ब्रेन ट्यूमर चिकित्सा और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (1R21CA141020-01) के लिए वेल्स जूनियर केंद्र के लिए फ्लोरिडा केंद्र द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
