Выявление и изоляция Медленно делящихся клеток глиобластомы человека в использовании Carboxy Fluorescein сукцинимидил Эстер (CFSE)
Summary
Это видео демонстрирует протокол применение флуоресцентного красителя карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) для идентификации и разделения различных субпопуляций клеток глиобластомы человека основана на частоте деления клеток.
Abstract
Опухоль неоднородность представляет собой фундаментальную функцию поддержки устойчивости опухолей и представляет собой центральное препятствие для развития терапевтических стратегий 1. Для преодоления проблемы гетерогенности опухоли, она имеет важное значение для разработки тестов и инструментов, позволяющих фенотипические (EPI) генетическая и функциональная идентификация и характеристика опухоли субпопуляции, которые приводят конкретных патологий, болезней и представляют собой клинически значимых целей. В настоящее время хорошо известно, что опухоли проявляют различные суб-фракции клеток с разными частотами деления клеток, и что функциональные критерии быть медленным езда на велосипеде положительно связаны с опухолью возможность формирования нескольких видов рака, включая тех, головного мозга, молочной железы, кожи и поджелудочной железы, а также лейкоза 2-8. Флуоресцентного красителя карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) была использована для отслеживания частотным разделением клеток в пробирке и в естественных условиях в кровь тumors и твердые опухоли, такие как глиобластома 2,7,8. Клеточной проникающих нефлуоресцентного про-препарат CFSE преобразуется внутриклеточных эстераз в флуоресцентным соединением, которое сохраняется внутри клеток путем ковалентного связывания с белками через реакцию его сукцинимидил фрагмент с внутриклеточными аминогруппы с образованием стабильных амидных связей 9. Флуоресцентный краситель равномерно распределяется между дочерними клетками при подразделений, ведущих к сокращению вдвое интенсивности флуоресценции с каждым делением клетки. Это позволяет отслеживать клетки тактовую частоту до восьми-десяти раундов деления 10. Мощность удержания CFSE был использован с клетками опухоли головного мозга для выявления и локализации медленно субпопуляции велосипеде (5% лучших красителей сохранив клетки) продемонстрировал быть обогащен в раковых стволовых клеток деятельность 2.
Этот протокол описывает технику окрашивания клеток с CFSE и изоляции отдельных популяций в культуре человеческих глиобластома (GBM)-клеток, полученных из обладающих различной разделение цены с помощью проточной цитометрии 2. Техника служит для выявления и локализации опухоли головного мозга медленно велосипедных популяцию клеток в силу своей способности удерживать CFSE маркировки.
Protocol
Discussion
Все большее число исследований показали важность медленного деления полуквартал клеток в раке, которые способствуют образованию опухолей и лечение сопротивлением 2-8. Поэтому очень важно, чтобы описать и стандартизировать экспериментальных методов, позволяющих изучение этой к?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Центром Флориде опухоли головного мозга Исследование, Престон А. Wells младший Центр лечения опухолей мозга и Национального института здоровья (1R21CA141020-01).
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
