Summary
Это видео демонстрирует протокол применение флуоресцентного красителя карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) для идентификации и разделения различных субпопуляций клеток глиобластомы человека основана на частоте деления клеток.
Abstract
Опухоль неоднородность представляет собой фундаментальную функцию поддержки устойчивости опухолей и представляет собой центральное препятствие для развития терапевтических стратегий 1. Для преодоления проблемы гетерогенности опухоли, она имеет важное значение для разработки тестов и инструментов, позволяющих фенотипические (EPI) генетическая и функциональная идентификация и характеристика опухоли субпопуляции, которые приводят конкретных патологий, болезней и представляют собой клинически значимых целей. В настоящее время хорошо известно, что опухоли проявляют различные суб-фракции клеток с разными частотами деления клеток, и что функциональные критерии быть медленным езда на велосипеде положительно связаны с опухолью возможность формирования нескольких видов рака, включая тех, головного мозга, молочной железы, кожи и поджелудочной железы, а также лейкоза 2-8. Флуоресцентного красителя карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) была использована для отслеживания частотным разделением клеток в пробирке и в естественных условиях в кровь тumors и твердые опухоли, такие как глиобластома 2,7,8. Клеточной проникающих нефлуоресцентного про-препарат CFSE преобразуется внутриклеточных эстераз в флуоресцентным соединением, которое сохраняется внутри клеток путем ковалентного связывания с белками через реакцию его сукцинимидил фрагмент с внутриклеточными аминогруппы с образованием стабильных амидных связей 9. Флуоресцентный краситель равномерно распределяется между дочерними клетками при подразделений, ведущих к сокращению вдвое интенсивности флуоресценции с каждым делением клетки. Это позволяет отслеживать клетки тактовую частоту до восьми-десяти раундов деления 10. Мощность удержания CFSE был использован с клетками опухоли головного мозга для выявления и локализации медленно субпопуляции велосипеде (5% лучших красителей сохранив клетки) продемонстрировал быть обогащен в раковых стволовых клеток деятельность 2.
Этот протокол описывает технику окрашивания клеток с CFSE и изоляции отдельных популяций в культуре человеческих глиобластома (GBM)-клеток, полученных из обладающих различной разделение цены с помощью проточной цитометрии 2. Техника служит для выявления и локализации опухоли головного мозга медленно велосипедных популяцию клеток в силу своей способности удерживать CFSE маркировки.
Protocol
1. Подготовка глиобластомы суспензии отдельных клеток
- Gliomasphere культура создается и поддерживается с помощью нейросфер анализа (NSA), как описано ранее 2,11,12.
- В соответствующее время для пассирования gliomaspheres, среда, содержащая сферы удаляют, помещают в соответствующий размер стерильной пробирке культуру ткани, и центрифугировали со скоростью 800 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Супернатант отбрасывают, а осадок сфер суспендируют в 1 мл 0,05% трипсина-EDTA и инкубировали при 37 ° C на водяной бане в течение 3-5 мин.
- Равном объеме соевого ингибитора трипсина затем используется, чтобы остановить трипсина деятельности.
- Клеточную суспензию осторожно пипеткой вверх и вниз для обеспечения однородности и полной нейтрализации активности трипсина.
- Клеточную суспензию снова центрифугировали со скоростью 800 оборотов в минуту в течение 5 мин. Супернатант удаляли, а клетки суспендируют в 1 мл NeuroCultНСК базальной среды.
- 10 мкл одно-клеточной суспензии смешивали с 90μl трипанового синего выполнять клеток.
2. Окраска сотовых трассировки карбоксифлуоресцеина сукцинимидил Эстер (CFSE) Зеленый флуоресцентный краситель
- За каждый 1 миллион клеток, чтобы быть пятнами, 1 мл окрашивания реагент получают путем добавления 1 мкл 5 мМ сотовых трассировки CFSE красителя (Molecular Probes, Invitrogen) к 1 мл NeuroCult НСК базальной среднего до получения конечной концентрации окрашивания 5 мкМ .
- Окрашивание реагентом, содержащим клетки хорошо перемешивают до однородности и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Во время инкубации ледяной NeuroCult НСК базальной Средний готовят тушения решение.
- Чтобы остановить процесс окрашивания, примерно 5-10 объемов ледяной закалки раствор добавляют к CFSE загруженных клеток.
- Затем раствор центрифугировали со скоростью 800 оборотов в минуту в течение 5 мин и супернатант отбрасывают.
- В гоявляется точкой, должны появиться осадок клеток в нижней части трубки с ярко-зеленым оттенком цвета, с указанием окрашивание прошло успешно.
- Клетки промывают ресуспендированием осадок в 1-2 мл свежего NeuroCult НСК основную среду, центрифугирования при 800 оборотов в минуту в течение 5 минут и отбросить супернатант. Эта процедура повторяется в общей сложности из трех стирок.
- После третьей стирки, клетки суспендируют в 1 мл NeuroCult НСК базальной среды и клеток выполняется.
- CFSE окрашенные клетки затем помещают в стерильные колбы культуры тканей на соответствующей плотности [50000 клеток / мл] и помещают в 37 ° C / 5% CO2 увлажненном инкубаторе.
3. Проверка CFSE Загрузка
- Клетки помещали в культуру NSA можно контролировать при флуоресцентного микроскопа для проверки CFSE окрашивания. На данном этапе все клетки обладают ярко-зеленого цвета (рис. 1). Кроме того, капля суспензии клеток сCFSE окрашенных клеток могут быть размещены на предметное стекло и покрывается покровным для визуализации клеток под флуоресцентным микроскопом.
- Успешное маркировки CFSE было еще раз подтверждено с помощью проточной цитометрии. Целых 1-5 х 10 5 клеток из каждой группы является достаточным для CFSE проверки окрашивания. CFSE загружаются и выгружаются клетки отрицательные контрольные клетки ресуспендируют соответственно в 1 х PBS или NeuroCult НСК основную среду при общем объеме 500 мкл и помещены в отдельные трубы FACS.
- Проточной цитометрии корректируется на основе своих инструкцию инструкция для соответствующих параметров. CFSE имеет максимальную длину волны возбуждения 492 нм и эмиссии максимум 517 нм.
- Во-первых, ненагруженных клеток контроль запуска и приобретенных события записываются в прямом и бокового рассеяния (FSC против SSC) и гистограмма участков, а основная популяция клеток закрытого типа (рис. 2A).
- Кроме того, CFSE загруженных клетки анализировали, используя тот же параметры используются для управления клетками (рис. 2В).
4. Выделение медленно делящиеся [т.е. CFSE Сохранение] клеточной популяции с помощью флуоресцентного Активированный сортировки клеток (FACS)
- После разделения, CFSE интенсивность уменьшается, и hGBM клетки образуют gliomaspheres, которые состоят из клеток с разными уровнями зеленых интенсивности флуоресценции (рис. 3). Когда gliomaspheres достигли среднего размера примерно 150-200 мкм в диаметре (примерно от 5 до 10 дней после загрузки CFSE в зависимости от темпов роста клеточной линии), в среду, содержащую сферы удаляют, помещают в соответствующий размер стерильной культуре ткани трубы, и центрифугировали при 800 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Одной клеточной суспензии получают, как описано в предыдущих шагах, и клетки суспендируют в PBS для подсчета клеток в целях подготовки клеточной суспензии с плотностью до 10 7 клеток на миллилитр.
- Кормовойэ ресуспендирования клеток в соответствующем объеме PBS, пропидия йодида (PI, Sigma, 500 мкг / мл) в концентрации 1 мкл / мл клеточной суспензии для исключения мертвых клеток при сортировке / анализировали с помощью проточной цитометрии.
- Два 15 мл стерильной культуре ткани труб каждая из которых содержит 1 мл полной среды NeuroCult НСК используется для сбора отсортированных медленно делящиеся клетки (CFSE сохранив клетки) и быстро делящиеся клетки (CFSE разбавления клеток).
- Во-первых, клеточной суспензии с ненагруженной группа ячейки проходят через проточной цитометрии.
- Клетки (события) приведены на основе рассеяния вперед (FSC) по сравнению сторону рассеяния (SSC) и параметров напряжения для обоих параметров настраиваются таким образом, что большинство клеток, включаются в поток сюжет.
- Чтобы исключить мертвые или поврежденные клетки, клетки строятся на основе реактивности SSC по сравнению с ИП и одного живого клеточной популяции (PI отрицательный) закрытого типа.
- Тогда однородная популяция клеток выбирается на основе Forward рассеяния (FSC) по сравнению сторону рассеяния (SSC).
- Однородной одного живого клеточной популяции, затем нанесены в виде гистограммы в зависимости от частоты ячейки по сравнению с CFSE интенсивности, установленной на логарифмической шкале. Интенсивность лазерного CFSE регулируется для того, чтобы разместить негативный сигнал от 0 до 100.
- Используя те же параметры и аналогичную стратегию стробирование, CFSE меченых клеток проходят через проточной цитометрии и проанализированы (рис. 4в).
- Затем медленно деления популяции клеток и общей численности населения (быстрее делящихся клеток) определены на основе их способности сохранить CFSE (CFSE высокой топ-5%, а CFSE низким дном 85%, соответственно).
- Эти различные клеточные популяции затем сортируются в отдельные 15 мл стерильной культуре ткани пробирки, содержащие 1 мл полной среды НБК.
- Упорядочить клетки затем центрифугировали со скоростью 800 оборотов в минуту в течение 5 мин.
- Супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в соответpriate объем среды (в зависимости от числа изолированных событий или гранул размером) и клеток выполняется.
- Клетки из различных популяций отсортированы затем помещали на 50000 клеток на миллилитр в соответствующей стерильной колбе культуры тканей и помещали в 37 ° C / 5% CO2 увлажненном инкубаторе в течение 5-10 дней, прежде чем серийно пересевать или использовать для последующих экспериментов.
5. Представитель Результаты
После загрузки CFSE, все клетки представляют интенсивной зеленой флуоресценции, как визуализация под микроскопом (рис. 1). Этот зеленый оттенка цвета можно увидеть даже невооруженным глазом (см. видео). Анализируя эти клетки с проточной цитометрии также показывает весьма интенсивным зеленой флуоресценции по сравнению с контрольными клетками (рис. 2). После покрытия CFSE загружен клеток в культуре нейросфер, эти клетки размножаются и образуют 150-200 мкм gliomaspheres в 5-10 дней. Поскольку клетки размножаются, т Он флуоресцентный краситель равномерно распределяется между дочерними клетками при подразделений, ведущих к сокращению вдвое интенсивности флуоресценции с каждым делением клетки. Глиобластомы функционально неоднородны и состоят из клеток пролиферирующих в различных масштабах времени. Метод, описанный в этой протокол позволяет идентифицировать и изолировать быстрого и медленного деления клеток в силу своих возможностей, чтобы разбавить или сохранить CFSE, соответственно (рис. 3, см. также видео).
Проточной цитометрии анализа диссоциированных gliomaspheres, полученные от CFSE загруженных клеток в сравнении с ненагруженной клетки демонстрирует разнообразные CFSE сохранения свойств (рис. 4). Быстро делящиеся клетки (внизу 85%) или медленным делением клеток (топ-5% - CFSE высокий) Выставка gliomapshere формирование способности при культивировании в условиях нейросфер анализа (рис. 5).
рисунке 1 "/>
Рисунок 1. Диссоциированных клеток опухоли сразу после загрузки с CFSE красителя. Клетки обладают ярко-зеленый цвет демонстрирует успешное маркировки. Оригинальный увеличение, 10 х.
Рисунок 2. CFSE Загрузка подтверждения с помощью проточной цитометрии.) Unloaded клеток, B) CFSE загружены клетки и C) Сравнение CFSE интенсивности флуоресценции в сравнении с загруженным ненагруженном клеток. Обратите внимание, что на несколько порядков разница в интенсивности флуоресценции между меченым и немеченого клеток.
Рисунок 3. Представитель gliomasphere получена из CFSE загруженных клетки через 6 дней после посева. Некоторые клетки обладают очень яркой CFSE окрашивания. Оригинальный увеличение, 63 х.
Рисунок 5. Представитель gliomaspheres, полученные от
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Все большее число исследований показали важность медленного деления полуквартал клеток в раке, которые способствуют образованию опухолей и лечение сопротивлением 2-8. Поэтому очень важно, чтобы описать и стандартизировать экспериментальных методов, позволяющих изучение этой конкретной субпопуляции клеток или в более общем плане сравнения групп населения с различными темпами роста. Использование CFSE для идентификации и выделения суб-фракции клеток в зависимости от их скорости деления клеток является отправной точкой для дальнейшего характеризующие эти специфические клеточные фракции, для успешного продвижения нашего понимания неоднородности описано в опухолях. В этом протоколе мы дали пример выявления и изоляции медленным делением населения в глиобластомы, но этот протокол также может быть применен к другим опухолевым клеткам, в том числе и не ограничивается молочной железы, поджелудочной железы и рака кожи. Downstream анализ этих популяций могут быть выполнены и может включать в себя функцРациональная исследований, сравнивающих пролиферативный потенциал 2, опухоли способности формирования 2, лечение чувствительности и (эпи) генетических сравнений. Эта методика также может быть использована с незлокачественные системы и могут быть применены, например, соматические стволовые / клеток-предшественников.
Критические технические моменты в процедуре участвуют адекватной диссоциации клеток трипсином, и достаточно ресуспендирования клеток в окрашивании СМИ, чтобы создать надлежащую плотность и обеспечить однородное окрашивание. Небольшой образец недавно окрашенные клетки должны быть проверены с помощью проточной цитометрии для обеспечения однородной маркировки характеризуется гауссовой как узкого профиля (см. Рисунок 2B). В случае гетерогенных начальной маркировки, предварительной сортировки могут быть выполнены для того, чтобы повысить пиковую резолюцию с узким диапазоном CFSE флуоресценции. Однако следует убедиться, что эта предварительной сортировки не выбрать для конкретного размера. Использование йодида пропидия (PI) маркировка яmportant для идентификации живых клеток и мертвых / поврежденных населения удалении от рабочего ворот, из-за смещения, что мертвые клетки можно ввести в низовьях приложений. Стоит отметить особенно высокую интенсивность флуоресценции маркировки CFSE и его потенциал для кровоточить в других каналов при использовании соседних флуорохромы в спектре, такие как флуорохромом фикоэритрин (PE). Важно отметить, что мультиплекс маркировки эксперименты с CFSE и флуорохромом антителами может потребовать компенсацию процесса в момент приобретения или анализа. Убедитесь, что имеются все необходимые элементы управления, которые включают неокрашенных клеток (при условии, уровень автофлуоресценции), отдельно окрашенных клеток и ваши конкретные комбинации. Несколько цвет маркировки в сочетании с CFSE лучше всего работает с флуорохромы, таких как Pacific Blue или аллофикоцианин (APC). Если цель эксперимента заключается в количественном абсолютное число клеточных делений в течение определенного периода времени, CFSE средней интенсивности флуоресценции (MFI) должна быть измерена как минимум двух различных моментов времени 2 с первого по крайней мере 24 часов после CFSE нагрузки. CFSE интенсивность резко падает в течение первых 24 часов при отсутствии деления клеток, а затем стабилизируется и снижается по отношению к клеточному делению. Необходимо также включить управление с непролиферативной CFSE загруженных клетки, обеспечивающие основу для CFSE спада интенсивности, не связанные с делением клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Центром Флориде опухоли головного мозга Исследование, Престон А. Wells младший Центр лечения опухолей мозга и Национального института здоровья (1R21CA141020-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
