Summary
Denna video protokoll demonstrerar tillämpningen av det fluorescerande färgämnet karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) för identifiering och separering av olika delpopulationer av celler i människans glioblastom baserade på frekvensen av celldelning.
Abstract
Tumör heterogenitet är en grundläggande funktion som stöder tumör robusthet och presenterar en central hinder för utvecklingen av terapeutiska strategier 1. För att övervinna problemet med tumören heterogenitet, är det viktigt att utveckla analyser och verktyg som gör det möjligt fenotypisk (EPI) genetisk och funktionell identifiering och karakterisering av tumör subpopulationer som driver specifika sjukdomar sjukdomar och representerar kliniskt relevanta mål. Det är nu väl fastställt att tumörer uppvisar distinkta sub-fraktioner av celler med olika frekvenser av celldelning, och att de funktionella kriterierna för att vara långsam cykling positivt associerad med tumörbildning förmåga i flera cancerformer inklusive de av hjärnan, bröst, hud och pankreas samt leukemi 2-8. Det fluorescerande färgämnet karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) har använts för att spåra frekvensen delning av celler in vitro och in vivo i blodburen tumors och solida tumörer, såsom glioblastom 2,7,8. Cellen-genomträngande icke-fluorescerande pro-drug CFSE omvandlas genom intracellulära esteraser till en fluorescerande förening, som kvarhålles inuti celler genom kovalent bindning till proteiner genom reaktion av dess succinimidyl grupp med intracellulära amingrupper för att bilda stabila amidbindningar 9. Den fluorescerande färgämne är jämnt fördelad mellan dotterceller vid divisioner, vilket leder till en halvering av fluorescensintensiteten med varje celldelning. Detta möjliggör spårning av cellcykeln frekvens upp till 8-10 omgångar division 10. CFSE retentionskapacitet användes med celler hjärntumör att identifiera och isolera en långsam cykling underpopulation (topp 5% färgämne kvarhållande celler) visade att anrikas i cancer stamceller aktivitet 2.
Detta protokoll beskriver tekniken för färgning celler med CFSE och isolering av enskilda populationer inom en kultur av humant glioblastoma (GBM)-härledda celler som har olika division priser med flödescytometri 2. Tekniken har tjänat till att identifiera och isolera en hjärntumör långsam cykling population av celler på grund av deras förmåga att behålla CFSE märkning.
Protocol
1. Förbereda Glioblastom enkelcellsuspension
- Gliomasphere kultur etableras och upprätthålls med hjälp av neurosfären analysen (NSA) som tidigare beskrivits 2,11,12.
- Vid lämplig tidpunkt för passage av gliomaspheres, mediet innehållande sfärerna avlägsnas, placeras i en lämplig storlek sterilt vävnadsodlings rör och centrifugerades vid 800 rpm (110 g) under 5 minuter vid rumstemperatur.
- Supernatanten kastas och pelleten av sfärer återsuspenderas i 1 ml 0,05% trypsin-EDTA och inkuberas vid 37 ° C i ett vattenbad under 3-5 minuter.
- En lika stor volym av sojaböntrypsininhibitor används sedan för att stoppa trypsinaktiviteten.
- Cellsuspensionen försiktigt pipetteras upp och ned för att säkerställa homogenitet och fullständig neutralisering av trypsin-aktivitet.
- Cellsuspensionen centrifugerades åter vid 800 rpm under 5 minuter. Supernatanten avlägsnas och cellerna återsuspenderas i 1 ml NeuroCultNSC Basal Medium.
- 10 | il av den inre-cellsuspensionen blandas med 90μl av trypanblått för att utföra en cellräkning.
2. Färgning med Cell Trace karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) Grön fluorescerande färgämne
- För varje 1 miljon celler att vara färgade, är 1 ml färgning reagens framställdes genom att 1 | il av 5 mM Cell Trace CFSE färgämne (Molecular Probes, Invitrogen) till 1 ml av NeuroCult NSC Basal Medium för att ge en slutlig koncentration färgning av 5 pM .
- Färgningen reagens innehållande cellerna blandas väl tills homogenitet och inkuberas vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Under inkuberingen iskall NeuroCult NSC Basal Medium bereds som härdning lösningen.
- För att stoppa färgningen processen, ca 5-10 volymer iskall släckning lösning till CFSE-laddade celler.
- Lösningen centrifugeras sedan vid 800 rpm under 5 min och supernatanten kastas bort.
- På thär punkt bör det verkar en pellet av celler på botten av röret med en ljus-grön nyans av färg, vilket indikerar färgningen var framgångsrik.
- Cellerna tvättas genom att återsuspendera pelleten i 1-2 ml färskt NeuroCult NSC Basal Medium, centrifugering vid 800 rpm under 5 min och kasta supernatanten. Denna procedur upprepas för totalt tre tvättar.
- Efter den tredje tvättningen, cellerna återsuspenderades i 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium och en cellräkning utförs.
- De CFSE färgade cellerna utströks därefter i sterila vävnadsodlingsflaskor vid en lämplig densitet [50.000 celler / ml] och placerades i en 37 ° C / 5% CO2 fuktad inkubator.
3. CFSE Laddar Verifiering
- Celler ut i NSA kulturen kan övervakas under ett fluorescerande mikroskop för att verifiera CFSE färgning. I detta skede, alla cellerna uppvisar klargrön färg (figur 1). Alternativt, en droppe av cellsuspensionen frånCFSE färgade celler skulle kunna placeras på ett objektglas och täcktes med ett täckglas för att visualisera celler under fluorescensmikroskop.
- Framgångsrik CFSE märkning bekräftas ytterligare genom flödescytometri. Så många som 1-5 x 10 5 celler från varje grupp är tillräcklig för CFSE färgning verifiering. Den CFSE laddad celler och obelastade negativa celler kontroll resuspenderas respektive i 1 x-PBS eller NeuroCult NSC Basal Medium för en total volym av 500 | il och placerades i separata rör FACS.
- Flödescytometern justeras utifrån dess bruksanvisning instruktioner för parametrar. CFSE har en maximal våglängd excitering av 492 nm och emissionsmaximum av 517 nm.
- Först är de obelastade kontrollcellerna springa och de förvärvade händelser registreras i fram-och sidospridning (FSC mot SSC) och histogram plottar, och den huvudsakliga cellpopulationen är gated (Figur 2A).
- Likaså är CFSE laddade cellerna analyseras med samma parameters används för kontrollceller (figur 2B).
4. Isolering av Slow-dela [dvs CFSE behålla] cellpopulation med fluorescerande cellsortering (FACS)
- Vid division är CFSE intensitet minskade och hGBM celler bildas gliomaspheres som består av celler som uppvisar olika nivåer av gröna fluorescensintensitet (Figur 3). När gliomaspheres har nått en genomsnittlig storlek av ca 150-200 | im i diameter (ungefär 5 till 10 dagar efter CFSE lastning beroende på cellinjen tillväxthastighet), mediet innehållande sfärerna avlägsnas, placeras i en lämplig storlek steril vävnadskultur röret, och centrifugerades vid 800 rpm under 5 minuter vid rumstemperatur.
- En enda cellsuspension framställdes såsom beskrivits i tidigare steg och cellerna återsuspenderas i PBS under en cellräkning för att framställa en cellsuspension med en densitet upp till 10 7 celler per milliliter.
- After återsuspendering av cellerna i en lämplig volym av PBS, är propidiumjodid (PI, Sigma, 500 ng / ml) tillsattes vid en koncentration av 1 | il / ml av cellsuspension att utesluta döda celler när de sorteras / analyserades med flödescytometri.
- Två 15 ml sterila vävnadsodling tuber à 1 ml av hela NeuroCult NSC medium används för att samla in de sorterade långsamt delande celler (CFSE kvarhållande celler) och de snabba delande celler (CFSE utspädning celler).
- Först cellsuspensionen från den obelastade cellgruppen löper genom flödescytometern.
- Cellerna (händelser) är ritade utifrån framåtspridning (FSC) versus sidospridning (SSC) och spänning parametrar för båda parametrarna justeras så att huvuddelen av cellerna ingår i flödet tomt.
- För att utesluta döda eller skadade celler, cellerna plottas utifrån SSC kontra PI reaktivitet och den enda levande cellpopulationen (PI negativ) är gated.
- Därefter är en homogen cellpopulation väljas baserat på forward spridning (FSC) versus sidospridning (SSC).
- Den homogena enda levande cellpopulation plottas sedan i ett histogram baserat på cell-frekvens mot CFSE intensitet ligger på en logaritmisk skala. Den CFSE laserintensitet justeras för att placera den negativa signalen mellan 0 och 100.
- Med samma parametrar och samma grind strategi är CFSE märkta celler löper genom flödescytometern och analyseras (Figur 4C).
- Därefter en långsam delning population av celler och en total befolkning (snabbare delande celler) identifieras baserat på deras förmåga att behålla CFSE (CFSE hög topp 5% och CFSE låg botten 85%, respektive).
- Dessa olika cellpopulationer sedan sorteras i separata 15 ml sterila rör vävnadsodling innehållande 1 ml komplett NSC medium.
- Sorterade celler centrifugeras sedan vid 800 rpm under 5 minuter.
- Supernatanten kastas och pelleten återsuspenderas i en lämpliglämpligt volym medium (beroende på antalet enskilda händelser eller pellets storlek) och en cellräkning utförs.
- Celler från de sorterade olika populationer därefter pläteras vid 50.000 celler per milliliter i en lämplig steril vävnadsodlingskolv och placerades i en 37 ° C / 5% CO2 fuktad inkubator under 5-10 dagar innan de seriellt passerades eller används för efterföljande experiment.
5. Representativa resultat
Efter CFSE laddning, alla celler presenterar en intensiv grön fluorescens som visualiserades under mikroskop (figur 1). Detta gröntonat färg kan ses även med blotta ögat (se videon). Analysera dessa celler med flödescytometri visar också mycket intensivt grön fluorescens jämfört med kontrollceller (figur 2). Vid plätering laddade CFSE celler i neurosfären kultur dessa celler föröka sig och bildar 150-200 nm gliomaspheres 5-10 dagar. Eftersom cellerna prolifererar, t Han fluorescerande färg är jämnt fördelad mellan dotterceller vid divisioner, vilket leder till en halvering av fluorescensintensiteten med varje celldelning. Glioblastom är funktionellt heterogen och består av celler förökar på olika tidsskalor. Den metod som beskrivs i detta protokoll möjliggör en att identifiera och isolera snabba och långsamma delande celler på grund av deras förmåga att späda ut eller behålla CFSE, respektive (figur 3, även se videon).
Flödescytometrianalys av dissocierade gliomaspheres genereras från CFSE-laddade celler i jämförelse med obelastade cellerna uppvisar olika egenskaper CFSE retention (Figur 4). Snabba delande celler (botten 85%) eller långsamt delande celler (topp 5% - CFSE hög) uppvisar gliomapshere bildar förmåga när de odlas i neurosfärceller testbetingelser (Figur 5).
Gure 1 "/>
Figur 1. Dissocierade tumörceller omedelbart efter lastning med CFSE färgämne. Cellerna uppvisar klargrön färg visar framgångsrika märkning. Ursprunglig förstoring, 10 x.
Figur 2. CFSE lastning bekräftelse med flödescytometri. A) obelastade celler, B) CFSE laddad celler och c) jämförelse CFSE fluorescensintensitet i belastade kontra obelastade celler. Observera att det finns flera tiopotenser skillnad i fluorescensintensitet mellan de märkta och omärkta celler.
Figur 3. En representativ gliomasphere härledd från en CFSE laddad cellen 6 dagar efter utstrykning. Vissa celler uppvisar mycket ljusa CFSE färgning. Ursprunglig förstoring, 63 x.
Figur 4. Representant flödescytometri tomter / histogram för isolering av snabba och långsamma delande celler 6 dagar efter CFSE färgning. A) FSC vs SSC för att visa hela cellpopulationen, B) SSC vs PI reaktivitet att utesluta döda eller skadade celler, C) FSC vs SSC till grinden en homogen levande cellpopulation, D) visar närvaron av CFSE kvarhållande celler 6 dagar efter CFSE märkning såsom framgår av en större fluorescensintensitet jämfört med den negativa kontrollen. Histogrammet visar också att CFSE intensitet förföll med tiden. E) Histogram visar gating strategi för att identifiera CFSE behåller celler (topp 5%) och CFSE utspädningsmedel celler (botten 85%).
Figur 5. Representativa gliomaspheres genereras från
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett ökande antal studier har visat hur viktigt det är en långsamt dela underavdelning av celler i cancer som bidrar till tumörbildning och behandling motstånd 2-8. Därför är det viktigt att beskriva och standardisera experimentella metoder som gör det möjligt att studera denna specifika subpopulation av celler eller mer allmänt att jämföra subpopulationer med olika tillväxttakt. Använda CFSE att identifiera och isolera undergrupper fraktioner av celler baserat på deras hastighet av celldelning är en utgångspunkt för att ytterligare karakterisera dessa specifika cellulära fraktioner och hjälper att främja vår förståelse av heterogenitet som beskrivs i tumörer. I detta protokoll vi gav exempel identifiera och isolera en långsam delande populationen inom glioblastom, men detta protokoll kan också tillämpas på andra tumörceller, inkluderande och inte begränsat till bröst, pankreas och hudcancer. Nedströms analys av dessa populationer kan utföras och kan innehålla funktional studier som jämför proliferativ potential 2, tumörbildning förmåga 2, behandling känslighet och (FEI) genetiska jämförelser. Denna metod kan också användas med icke-cancerösa system och kan tillämpas, exempelvis somatiska stam / celler prekursorceller.
Kritiska tekniska punkter i förfarandet inblandade tillräcklig dissociation av celler med trypsin och tillräcklig återsuspension av celler i färgning medierna att fastställa en lämplig densitet och säkerställa homogen färgning. Ett litet urval av nyaktiverad färgade celler bör kontrolleras av flödescytometri för att säkerställa homogen märkning som kännetecknas av en gaussisk-liknande smal profil (se figur 2B). I fallet med heterogena inledande märkning, kan en försorterar utföras för att förbättra upplösning av toppar med snävare intervall av CFSE fluorescens. Men det bör säkerställas att denna försorterar inte välja för specifika storlekar. Användningen av propidiumjodid (PI) märkning är i.VIKTIG för att identifiera levande celler och för död / skadade befolkningen bort från arbetsområdet porten, på grund av fördomar som döda celler kan införa i efterföljande program. Det är värt att notera den särskilt hög fluorescens intensitet CFSE märkning och dess potential att blöda i andra kanaler när man använder angränsande fluorokromer i spektrumet, såsom fluorokromen fykoerytrin (PE). Det är viktigt att notera att multiplexa märkning experiment med CFSE och fluorokromkonjugerade antikroppar kan kräva en ersättning process vid förvärvet eller analys tid. Var noga med att ha alla nödvändiga kontroller som inkluderar ofärgade celler (ger nivå autofluorescens), enstaka färgade celler och dina specifika kombination. Flera färger märkning i kombination med CFSE fungerar bäst med fluorokromer som Pacific Blue och allofykocyanin (APC). Om syftet med experimentet är att kvantifiera det totala antalet celldelningar under en definierad tidsperiod, CFSE genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) måste mätas vid minst två olika tidpunkter 2 med den första minst 24 timmar efter CFSE lastning. CFSE intensitet sjunker drastiskt inom de första 24 timmarna i frånvaro av celldelning men stabiliserar och minskar i förhållande till celldelning. Det är också nödvändigt att inkludera en kontroll med icke-proliferativa CFSE laddade celler ger baslinjen för CFSE intensitet röta inte är relaterade till celldelning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Florida Centrum för hjärntumör Research, Preston A. Wells Jr Centrum för hjärntumör Terapi och National Institutes of Health (1R21CA141020-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
