Summary
Diese Video-Protokoll zeigt die Anwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) zur Identifikation und Trennung von verschiedenen Subpopulationen von Zellen in humanen Glioblastomzellen nach der Häufigkeit des Zellteilung basiert.
Abstract
Tumorheterogenität stellt eine grundlegende Funktion tragenden Tumor Robustheit und stellt eine zentrale Hindernis für die Entwicklung von therapeutischen Strategien ein. Um das Problem der Tumorheterogenität zu überwinden, ist es wichtig, Tests und Tools ermöglichen phänotypische, (epi) genetische und funktionelle Identifizierung und Charakterisierung von Tumor-Subpopulationen, die spezifische Krankheit Krankheiten zu fahren und stellen klinisch relevante Ziele zu entwickeln. Es wird jetzt allgemein anerkannt, dass Tumore unterschiedlichen Sub-Fraktionen von Zellen mit unterschiedlichen Frequenzen der Zellteilung zeigen, und dass die funktionalen Kriterien der langsamen Rad positiv mit Tumorbildung Fähigkeit in mehreren Krebsarten einschließlich des Gehirns, der Brust, der Haut und die damit verbundenen Bauchspeicheldrüse sowie Leukämie 2-8. Der Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) hat zum Verfolgen der Teilung Häufigkeit von Zellen in vitro und in vivo im Blut übertragbaren t verwendetumors und soliden Tumoren wie zB Glioblastoma 2,7,8. Das Zell-permeierenden nicht fluoreszierenden Prodrug CFSE wird durch intrazelluläre Esterasen in eine fluoreszierende Verbindung, die innerhalb der Zellen durch kovalentes Binden an Proteine durch Reaktion seiner Succinimidyl-Komponente mit intrazellulären Amingruppen zu bilden stabile Amidbindungen 9 zurückgehalten wird umgewandelt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird gleichmäßig zwischen Tochterzellen auf Bereiche verteilt werden, was zu einer Halbierung der Fluoreszenzintensität mit jeder Zellteilung. Dies ermöglicht die Verfolgung von Zellzyklus Frequenz von bis zu 8-10 Runden Teilung 10. CFSE Rückhaltevermögen wurde mit Hirntumorzellen zur Identifizierung und Isolierung eines langsamen Rad Subpopulation (obere 5% Farbstoff haltenden Zellen) nachgewiesen, bei Krebs Stammzellaktivität 2 angereichert werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Technik der Färbung von Zellen mit CFSE und die Isolierung einzelner Populationen innerhalb einer Kultur von menschlichen GlioBlastom (GBM)-abgeleiteten Zellen mit unterschiedlichen Teilungsraten mittels Durchflusszytometrie 2. Die Technik hat dazu gedient, zu identifizieren und zu isolieren, einen Hirntumor slow-cycling Population von Zellen, die aufgrund ihrer Fähigkeit, die CFSE Kennzeichnung erhalten.
Protocol
Ein. Vorbereiten Glioblastoma Single Cell Suspension
- Gliomasphere Kultur aufgebaut und gepflegt mit dem Neurosphäre Assay (NSA), wie zuvor beschrieben 2,11,12.
- Zum geeigneten Zeitpunkt für Passagieren der gliomaspheres wird das Medium mit den Kugeln entfernt, in einer geeigneten Größe sterilen Zellkulturgefäß und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Der Überstand wird verworfen und das Pellet von Kugeln wird in 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA resuspendiert und bei 37 ° C in einem Wasserbad für 3-5 min.
- Ein gleiches Volumen von Sojabohnentrypsininhibitor wird dann verwendet, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen.
- Die Zellsuspension wird sanft auf und pipettiert auf Homogenität und eine vollständige Neutralisation der Trypsin-Aktivität zu gewährleisten.
- Die Zellsuspension wird erneut bei 800 UpM für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen werden gewaschen und in 1 ml NeuroCultNSC Basal Medium.
- 10 ul der Einzelzell-Suspension wird mit 90μl der Trypanblau eine Zellzahl durchzuführen vermischt.
2. Färbung mit Cell Trace Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Green Fluorescent Dye
- Für jede 1 Mio. Zellen angefärbt werden, wird 1 ml Färbereagenz durch Zugabe von 1 ul 5 mM Zelle Trace CFSE Farbstoff (Molecular Probes, Invitrogen) zu 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium, um eine endgültige Färbung Konzentration von 5 uM geben bereit .
- Das Färbereagens, welche die Zellen ist gut bis Homogenität gemischt und bei Raumtemperatur für 10 min.
- Während der Inkubation wird eiskalten NeuroCult NSC Basal Medium als Abschrecken Lösung hergestellt.
- Um die Färbung zu beenden, wird ungefähr 5-10 Volumina eiskaltem Abschrecken Lösung der CFSE-beladenen Zellen zugegeben.
- Die Lösung wird dann bei 800 Upm 5 min zentrifugiert und der Überstand wird verworfen.
- An thPunkt ist, sollte es ein Pellet von Zellen am Boden des Röhrchens werden mit einem hell-grünen Farbton der Farbe, der angibt, die Färbung war erfolgreich.
- Die Zellen werden durch Resuspendieren des Pellets in 1-2 ml frisches NeuroCult NSC Basal Medium, Zentrifugieren bei 800 UpM für 5 min und Verwerfen des Überstands gewaschen. Diese Prozedur wird für insgesamt drei Waschungen wiederholt.
- Nach der dritten Wäsche werden die Zellen in 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium und eine Zellzahl resuspendiert durchgeführt wird.
- Die CFSE gefärbten Zellen werden dann in sterilem Gewebekulturflaschen in angemessener Dichte [50.000 Zellen / ml] plattiert und in einem 37 ° C / 5% CO2 befeuchteten Inkubator.
3. CFSE Loading Verification
- Zellen in Kultur NSA ausplattiert können unter einem Fluoreszenzmikroskop zu CFSE Färbung überprüfen zu überwachen. In diesem Stadium weisen alle Zellen hellgrüne Farbe (Abbildung 1). Alternativ kann ein Tropfen der Zellsuspension ausCFSE gefärbten Zellen konnten auf einem Objektträger platziert und mit einem Deckglas abgedeckt, um Zellen unter dem Fluoreszenz-Mikroskop sichtbar zu machen.
- Erfolgreiche CFSE Kennzeichnung ist ferner über Durchflusszytometrie bestätigt. So viele wie 1-5 x 10 5 Zellen von jeder Gruppe ist ausreichend für CFSE Färbung Verifikation. Die CFSE geladen Zellen und unbelasteten negativen Kontrollzellen jeweils in 1 x PBS-oder NeuroCult NSC Basal Medium bei einem Gesamtvolumen von 500 ul resuspendiert und in separaten FACS-Röhrchen.
- Das Durchflusszytometer wird auf der Grundlage seiner Bedienungsanleitung Anweisungen für Parameter angepasst. CFSE eine Wellenlänge Anregungsmaximum von 492 nm und einer Emission von maximal 517 nm aufweist.
- Zunächst werden die unbeladenen Kontrollzellen laufen und die erworbenen Ereignisse in Vorwärts-und side scatter (FSC vs SSC) und Histogramm aufgezeichnet und die wichtigsten Zellpopulation gated (Abbildung 2A).
- Ähnlich werden die CFSE beladenen Zellen analysiert unter Verwendung der gleichen Parameters verwendet für Kontrollzellen (Abbildung 2B).
4. Isolierung der Slow-Division [dh CFSE Sicherungsring] Zellpopulation mit Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)
- Nach Spaltung wird CFSE Intensität verringert und hGBM Zellen zu bilden, der aus Zellen gliomaspheres ausstellenden verschiedenen Ebenen der grünen Fluoreszenz-Intensität (Abbildung 3) zusammengesetzt sind. Wenn die gliomaspheres haben eine durchschnittliche Größe von etwa 150 bis 200 um Durchmesser (ca. 5 bis 10 Tage nach der CFSE Beladung in Abhängigkeit von der Zelllinie Wachstumsrate) erreicht, wird das Medium mit den Kugeln entfernt, in einer geeigneten Größe steriler Gewebekultur Rohr und zentrifugiert bei 800 UpM für 5 min bei Raumtemperatur.
- Eine Einzelzell-Suspension wird hergestellt, wie im Stand der beschriebenen Schritte und die Zellen werden in PBS für eine Zellzahl resuspendiert, um eine Zellsuspension mit einer Dichte von bis zu 10 7 Zellen pro Milliliter vorzubereiten.
- Achterner Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen PBS wird Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml) in einer Konzentration von 1 ul / ml Zellsuspension, um tote Zellen auszuschließen, wenn sortiert / mittels Durchflusszytometrie analysiert zugegeben.
- Zwei 15 ml steriler Gewebekultur Röhrchen mit jeweils 1 ml der vollständigen NeuroCult NSC Medium verwendet wird, um die sortierten langsamen teilende Zellen (CFSE Zurückhalten Zellen) und die schnellen teilenden Zellen (CFSE Verdünnen Zellen) zu sammeln.
- Zuerst wird die Zellsuspension aus der unbelasteten Zellengruppe durch das Durchflusszytometer laufen.
- Die Zellen (Ereignisse) basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC) versus Seitenstreuung (SSC) und Spannungsparameter für beide Parameter aufgetragen werden so eingestellt, dass die Mehrzahl der Zellen in der Strömung Parzelle enthalten sind.
- Um tote Zellen auszuschließen oder beschädigt werden die Zellen basierend auf SSC gegen PI Reaktivität aufgetragen und die einzelne lebende Zellpopulation (PI negativ) ist gated.
- Dann wird eine homogene Zellpopulation basierend auf f ausgewähltorward Scatter (FSC) versus seitliche Streulicht (SSC).
- Die homogene einzelne lebende Zellpopulation wird dann in einem Histogramm Zelle Frequenz gegenüber CFSE Intensität auf einer logarithmischen Skala eingestellt Basis aufgetragen. Die CFSE Laserintensität eingestellt wird, um das negative Signal zwischen 0 und 100 zu platzieren.
- Mit den gleichen Parametern und eine ähnliche Gating Strategie werden die markierten Zellen durch CFSE Durchflusszytometer laufen und analysiert (4C).
- Anschließend werden ein langsames Dividieren Population von Zellen und einer Gesamtpopulation (schneller teilenden Zellen), basierend auf ihrer Fähigkeit, CFSE (CFSE Hochspitze 5% und CFSE niedrigem Boden 85%, jeweils) zu halten identifiziert.
- Diese unterschiedlichen Zellpopulationen werden dann in separate 15 ml sterile Zellkultur Röhrchen 1ml von kompletten NSC Medium sortiert.
- Sortierten Zellen werden dann bei 800 Upm 5 min zentrifugiert.
- Überstand wird verworfen und das Pellet wird resuspendiert in einem entsprechendsprechende Volumen Medium (abhängig von der Anzahl der getrennten Ereignissen oder Pelletgröße) und einer Zellzahl erfolgt.
- Zellen aus den verschiedenen sortierten Populationen werden dann bei 50.000 Zellen pro Milliliter in einer geeigneten sterilen Zellkulturflasche ausplattiert und in einem 37 ° C / 5% CO2 befeuchteten Inkubator für 5-10 Tage, bevor sie seriell passagiert oder zur nachgeschalteten Experimenten.
5. Repräsentative Ergebnisse
Nach CFSE Laden, präsentieren alle Zellen eine intensive grüne Fluoreszenz sichtbar unter dem Mikroskop (Abbildung 1). Diese grün getönten Farbe kann sogar mit dem bloßen Auge (siehe Video) gesehen werden. Die Analyse dieser Zellen mit Durchflusszytometrie zeigt auch sehr intensive grüne Fluoreszenz im Vergleich zur Kontroll-Zellen (Abbildung 2). Nach plating CFSE geladen Zellen in Neurosphäre Kultur, vermehren sich diese Zellen und bilden 150-200 um gliomaspheres in 5-10 Tagen. Da die Zellen proliferieren, t er Fluoreszenzfarbstoff gleichmäßig zwischen Tochterzellen auf Bereiche verteilt werden, was zu einer Halbierung der Fluoreszenzintensität mit jeder Zellteilung. Glioblastome sind funktionell heterogen und werden von Zellen proliferieren auf unterschiedlichen Zeitskalen zusammengesetzt. Das Verfahren in dieser beschriebenen Protokoll ermöglicht einem, zu identifizieren und zu isolieren, schneller und langsamer teilenden Zellen durch ihre Fähigkeit, zu verdünnen oder zu behalten CFSE bzw. (Abbildung 3, siehe auch die Video).
Durchflusszytometrieanalyse von dissoziierten gliomaspheres aus CFSE-beladenen Zellen im Vergleich zur unbelasteten Zellen erzeugt zeigt diverse CFSE Retentionseigenschaften (Abbildung 4). Schnell teilende Zellen (unten 85%) oder langsam teilenden Zellen (die obersten 5% - CFSE hoch) Ausstellung gliomapshere Fähigkeit zur Bildung, wenn in den Neurosphäre Testbedingungen (Abbildung 5) kultiviert.
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Abbildung 1. Dissoziierte Tumorzellen unmittelbar nach dem Laden mit CFSE Farbstoff. Die Zellen zeigen hellgrüne Farbe zeigen erfolgreiche Kennzeichnung. Ursprüngliche Vergrößerung, 10 x.
Abbildung 2. CFSE Laden der Bestätigung mittels Durchflusszytometrie. A) unbeladen Zellen, B) CFSE geladen Zellen und C) im Vergleich CFSE Fluoreszenzintensität im beladenen gegenüber unbelasteten Zellen. Beachte, dass es mehrere Größenordnungen Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den markierten und unmarkierten Zellen.
Abbildung 3. Ein Vertreter gliomasphere aus einer CFSE-beladenen Zelle 6 Tage nach dem Ausplattieren abgeleitet. Einige Zellen weisen sehr hell CFSE Färbung. Ursprüngliche Vergrößerung, 63 x.
Abbildung 4. Vertreter Durchflusszytometrie Grundstücke / Histogramme zur Isolierung von schnellen und langsamen teilenden Zellen 6 Tage nach CFSE Färbung. A) FSC vs SSC den gesamten Zellpopulation zeigen, B) SSC vs PI Reaktivität, um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen, C) FSC vs SSC zum Gate eine homogene Live Zellpopulation, D) zeigt das Vorhandensein von CFSE Beibehaltung Zellen 6 Tage nach CFSE Kennzeichnung durch eine größere Intensität der Fluoreszenz im Vergleich zur negativen Kontrolle nachgewiesen. Das Histogramm zeigt auch, dass die CFSE Intensität über die Zeit. E verfiel) Histogramm zeigt die Gating-Strategie CFSE Beibehaltung Zellen (Top 5%) und CFSE Verdünnen Zellen (unten 85%) zu identifizieren.
Abbildung 5. Vertreter gliomaspheres generiert aus
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Discussion
Eine wachsende Zahl von Studien haben die Bedeutung eines langsamen teilende Unterabteil von Zellen in Krebszellen, die Tumorbildung und Therapieresistenz 2-8 beitragen demonstriert. Daher ist es wichtig, zu beschreiben und zu standardisieren experimentellen Methoden, mit denen das Studium dieser spezifischen Subpopulation von Zellen oder mehr allgemein Subpopulationen mit unterschiedlichen Wachstumsraten vergleichen. Mit CFSE zu identifizieren und zu isolieren, Sub-Fraktionen von Zellen auf ihre Rate der Zellteilung ist ein Ausgangspunkt zur weiteren Charakterisierung dieser spezifischen zellulären Fraktionen, dazu beitragen, unser Verständnis der Heterogenität in Tumoren beschrieben voranzutreiben. In diesem Protokoll gaben wir das Beispiel Identifizierung und Isolierung eines langsamen teilende Population innerhalb Glioblastom, aber dieses Protokoll kann auch auf andere Tumorzellen, einschließlich und nicht an Brust-, Bauchspeicheldrüsen-und Hautkrebs beschränkt angewendet werden. Downstream-Analyse dieser Bevölkerungsgruppen durchgeführt werden kann und kann Funkt gehörenional Studien zum Vergleich Proliferationspotential 2, Tumorbildung Möglichkeit 2, Behandlung Empfindlichkeit und (epi) genetische Vergleiche. Diese Methodik kann auch mit nicht krebsartigen Systeme verwendet werden und kann angewendet werden, zum Beispiel zum somatischen Stammzellen / Vorläuferzellen.
Kritische Punkte innerhalb des technischen Verfahren beteiligten ausreichende Dissoziation von Zellen mit Trypsin und ausreichend Resuspension der Zellen in den Medien, um eine Färbung angemessenen Dichte einrichtet und homogene Färbung. Eine kleine Probe des frisch gefärbten Zellen mittels Durchflusszytometrie sollte überprüft werden, um homogene Kennzeichnung durch eine Gauß-artige schmalen Profils (siehe 2B) dadurch zu gewährleisten. Im Falle der heterogenen anfänglichen Kennzeichnung kann eine Vorsortierung durchgeführt, um Peakauflösung mit engeren Bereich von CFSE Fluoreszenz verbessern. Allerdings ist darauf zu achten, dass diese Vorsortierung nicht für bestimmte Größen zu wählen. Die Verwendung von Propidiumiodid (PI) ist i EtikettierungW ichtig zum Identifizieren lebenden Zellen und für tote / Beschädigt Population Entnahme aus dem Arbeitsraum Gatter, aufgrund der Vorspannung, dass tote Zellen können in nachfolgenden Anwendungen einzubringen. Es ist erwähnenswert, die besonders hohe Fluoreszenzintensität des CFSE Kennzeichnung und ihr Potential in andere Kanäle bluten bei Verwendung benachbarte Fluorochromen im Spektrum wie das Fluorochrom Phycoerythrin (PE). Es ist wichtig zu beachten, dass Multiplex-Kennzeichnung Experimente mit CFSE und Fluorochrom-konjugierten Antikörpern kann eine Entschädigung Prozess auf den Erwerb oder die Analyse erfordern. Achten Sie darauf, alle erforderlichen Kontrollen, die ungefärbte Zellen (vorausgesetzt, das Niveau der Autofluoreszenz), einzeln gefärbten Zellen und Ihre spezifische Kombination einbeziehen müssen. Multiple-Farbmarkierung in Kombination mit CFSE funktioniert am besten mit Fluorochromen wie Pacific Blue oder Allophycocyanin (APC). Wenn der Zweck des Experiments ist es, die absolute Anzahl der Zellteilungen über einen definierten Zeitraum, der CFS quantifizierenE mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) hat, um bei einem Minimum von zwei verschiedenen Zeitpunkten gemessen werden weist zwei mit dem ersten wenigstens 24 Stunden nach CFSE Belastung. CFSE Intensität sinkt drastisch innerhalb der ersten 24 Stunden in Abwesenheit der Zellteilung aber dann stabilisiert und nimmt in Bezug auf die Zellteilung. Es ist auch notwendig, um ein Steuersignal mit nicht-proliferative CFSE beladenen Zellen Bereitstellen der Grundlinie für CFSE Intensitätsabfall nicht Zellteilung enthalten sollen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Florida Center for Brain Tumor Research, Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapie und den National Institutes of Health (1R21CA141020-01) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
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