Summary
Glasullsprodukter filter har använts för att koncentrera vattenburna virus genom ett antal forskargrupper runt om i världen. Här visar vi en enkel metod för att konstruera filter glasull och demonstrera filter också effektivt att koncentrera vattenburna virus, bakterie-och protozo patogener.
Abstract
Nyckeln första steget i utvärderingen patogener nivåer i misstänkt förorenat vatten är koncentration. Koncentration metoder tenderar att vara specifika för en viss patogen grupp, till exempel US Environmental Protection Agency Metod 1623 för Giardia och Cryptosporidium 1, vilket innebär att flera metoder krävs om provtagningen programmet riktar mer än en patogen grupp. En annan nackdel med nuvarande metoder är att utrustningen kan vara komplicerad och dyr, till exempel VIRADEL-metoden med den 1MDS patronfilter för koncentrering virus 2. I den här artikeln beskriver vi hur man konstruerar filter glasullsprodukter för att koncentrera vattenburna patogener. Efter filtret eluering är koncentratet mottaglig för en andra koncentration steg, såsom centrifugering, följt av detektion av patogener och räkning av kulturella eller molekylära metoder. Filtren har flera fördelar. Konstruktionen är lätt och filter kan byggas för att enNY storlek för att uppfylla specifika urvalskriterier. Filterdelarna är billiga, vilket gör det möjligt att samla ett stort antal prover utan att allvarligt påverka en projektbudget. Stora provvolymer (100s till 1.000 s L) kan koncentreras, beroende på graden av igensättning från prov grumlighet. Filtren är mycket portabel och med minimal utrustning, såsom en pump och flödesmätare, kan de genomföras i fältet för provtagning färdiga dricksvatten, ytvatten, grundvatten och jord avrinning. Slutligen är glasull filtrering effektiv för att koncentrera olika patogener typer så bara en metod är nödvändig. Här rapporterar vi om filter effektivitet i att koncentrera vattenburna mänskligt enterovirus, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, och aviär influensavirus.
Protocol
1. Förbereda Glasull
- Före och efter att varje sats av filter, sterilisera arbetsområdet med 10% blekmedel lösning.
- Sätt på handskar och klänning. Sterilisera en hink genom autoklavering vid 121 ° C och 15 psi under minst 20 minuter. Placera glasull i den sterila hinken.
- Mätta glasull med omvänd osmos och låt blöt under 15 minuter.
- Dränera omvänd osmos av vatten från skopan.
- Mätta glasull med 1 M HCl och låt blöt under 15 minuter.
- Dränera 1 M HCl från skopan.
- Skölj glasull med omvänd osmos.
- Blanda ordentligt.
- Kontrollera pH med användning av pH-papper och upprepa omvänd osmos skölj tills ett neutralt pH uppnås.
- Häll av sköljvattnet.
- Mätta glasull med 1 M NaOH och låt blöt under 15 minuter.
- Dränera 1 M NaOH från skopan.
- REPEAT för omvänd osmos skölj tills ett neutralt pH uppnås.
- Häll av sköljvattnet.
- I stället för en hink, kan en glasull bricka konstrueras, som är liknande i konstruktion till en glaspipett bricka (figur 1).
- Täcka glasull fullständigt med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) justerad till pH 6,8.
- Använd förberedd glasull omedelbart eller förvara vid 4 ° C. Det kan lagras i upp till två veckor. Innan du använder, se till att pH-värdet är neutralt, eftersom det kommer att öka över tiden. Om pH är inte neutral, åter-spola med steril fosfatbuffrad saltlösning (pH 6,8).
2. Montering av filter Glasull
- Borra ett 11/16 cm stort hål i PVC mössor och trådar knacka så hane adapter nylon beslag kan skruvas in i Caps. Detta steg är nödvändigt endast för den första enheten. Därefter kan kapsylerna användas i många år. Applicera Teflontejp till nylon beslag gängorna och skruven till Caps.
- Packa PVC-röret med små bitar av glasull. Använd en metall kolv, som en bilmotor ventil, att packa tätt. Förpackning kräver inte stor kraft. Packa tätt nog så att glasull hålls på plats och kanaler inte bildas. Emellertid inte packa inte så tätt vatten inte kan strömma genom filtret. När packad lämpligt, bör en flödeshastighet av 4 till 5 liter per minut kunna erhållas när filtret är fäst vid tappställena med tryck mellan 40-60 psi. För storleken på PVC-rör som anges i detta protokoll, ca 85 gram tvättas och förpackas glasull används per rör. Tara den tomma PVC-röret på en toppmatad balans och förpackning med tvättad glasull tills röret massan ökar 85 gram.
- Sätt polypropylen nät i PVC-mössor med hane adapter bifogade nylon beslag.
- Tillämpas teflontejp att de gängade delarna av PVC-röret.
- Skruva på PVC Caps till PVC pIPE och etiketten en filteränden inflödet och den andra änden av utflödet. Detta är viktigt senare för elueringssteget. Vilken ände är märkt inflöde spelar ingen roll.
- Push 60 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (pH = 6,8) in i filtret med användning av en kateter tippas spruta. Överskott kommer att komma ut motsatta änden.
- Wrap slutar tätt med Parafilm för att undvika läckage. Filter kan förvaras upp till 30 dagar vid 4 ° C.
3. Provtagning
- Sterilisera slangar som används för provtagning av cirkulation eller nedsänkning artiklar för 30 minuter i 0,525% NaClO (dvs en 10% lösning av standard blekmedel). Följa detta genom att dränera hypokloritlösning och neutralisera med 0,05% natriumtiosulfat, framställdes genom tillsats av 25 ml av en 2% stamlösning vattenfritt natriumtiosulfatlösning till en liter omvänd osmos.
- För prov vatten med ett pH större än 7,5, justera pH till mellan 6,5 och 7,0 med HCl. HCl-koncentration kan variera från 0,25M till 1 M. Fyra liter 0,5 M HCl är i allmänhet tillräckligt för två 800 liters prov, beroende på vattnets omgivande pH och buffertkapacitet. Injicera HCl under provtagning med en peristaltisk pump eller venturirör (figur 2). Justera pumphastigheten eller Venturi-öppning för att uppnå mål-pH. Mät pH vid provledningen utloppet med en mätare fält pH.
- Använd ett förfilter om glasullsprodukter filter träskor från vatten med hög grumlighet. (Specifikationer för förfilter och dess hus är i Materials listan på nätet.) Eftersom patogener kan kopplas till partiklar som fastnar på förfiltret måste det elueras tillsammans med glasull filtret (se nedan).
- Justera flödeshastigheten till mellan 2 och 4 liter per minut. Typiska provvolymer är mellan 200 och 1.500 liter.
- Koppla bort filtret glasull och förvara i en plast steril påse vid 4 ° C i upp till 48 timmar.
4. Eluering
- Anbringa glasull filtret till en ringstå med provet inströmningsänden pekande nedåt in i en polypropenflaska. Eluera motsatt riktning av provtagningsflödet.
- Push 80 ml sterilt 3% nötkött-extrakt i 0,05 M glycin med pH 9,5 in i filtret.
- Vänta 15 minuter.
- Push annan 80 ml sterilt 3% nötkött-extrakt i 0,05 M glycin med pH 9,5 in i filtret.
- Skjut luft noggrann filtret tills skummet kommer ut ur filtret inloppet.
- Justera eluatet pH till mellan 7,0 och 7,5 med 1 M HCl.
- Lagra eluatet vid 4 ° C under upp till 24 timmar eller vid -20 ° C under längre tidsperioder.
- Eluera förfilter om en sådan används. Skruva den övre delen av höljet patronen och häll bort alla kvarvarande vatten inuti huset medan man håller förfilter i stället med sterila handskar på händerna.
- Ta bort förfiltret från huset kassetten och sätt den till en 15 "x 6" zip-lock påse.
- Häll 200 ml av steril 3% nötkött-extrakt i 0,05 M glycin med ett pH på 9,5 i påsen och förslut ordentligt med zip-lås.
- Vänd säckar förfiltret flera gånger så att hela ytan kommer i kontakt med nötkött extraktet.
- Vänta 15 minuter, ibland inverterande och massera säckar förfiltret.
- Öppna zip-lås. Grip påsen runt förfiltret hårt för att pressa ut så mycket nötkött extrakt som möjligt och dra förfilter ut med sterila handskar på händerna.
- Häll eluatet köttextrakt i en polypropenflaska.
- Justera eluatet pH till mellan 7,0 och 7,5 med 1 M HCl.
- Lagra eluatet vid 4 ° C under upp till 24 timmar eller vid -20 ° C under längre tidsperioder. Förfiltret eluatet kan analyseras separat för patogener eller kombineras med glasull filtret eluat.
5. Representativa resultat
| Patogen | Vatten Grumlighet Level (NTU) ett | Mängden ympade / L b, c, d | % Utvunnet ± 1 SD | Antal oberoende studier |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 0,5 | 500 | 81% ± 11 | 7 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 0,5 | 5000 | 67% ± 12 | 8 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 215 | 500 | 59% ± 32 | 7 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 215 | 5000 | 38% ± 22 | 6 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 447 | 500 | 56% ± 18 | 8 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 447 | 5000 | 63% ± 37 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 5 | 38% ± 14 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 50 | 53% ± 19 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 5 | 40% ± 16 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 50 | 30% ± 6 | 6 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 5 | 33% ± 13 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 50 | 28% ± 11 | 8 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 5 | 29% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 500 | 56% ± 16 | 8 |
| Salmonella enterica | 215 | 5 | 32% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica 215 | 500 | 34% ± 11 | 6 | |
| Salmonella enterica | 447 | 5 | 34% ± 18 | 8 |
| Salmonella enterica | 447 | 500 | 31% ± 24 | 8 |
- Nefelometrisk Turbiditet Enhet
- Enterovirus som räknas qPCR som genomiska kopior / L
- C. parvum räknas med immunofluorescens som oocystor
- S. enterica räknas som kultur som kolonibildande-enheter
Tabell 1. Glasull koncentration med varierande vatten turbiditet och patogener tätheter.
| Patogen | Vatten provlokaliseringen | Mängden ympade / L en | % Reco mycket |
| Fågelinfluensa H5N2 | Sundi Lake, Anchorage Borough | 2500 | 42,9% |
| Fågelinfluensa H5N2 | Minto Flats, Fairbanks North Star Borough | 2500 | 36,7% |
| Fågelinfluensa H5N2 | Portage Valley, Anchorage Borough | 2500 | 7,8% |
| Fågelinfluensa H5N2 | Potter Marsh, Anchorage Borough | 2500 | 41,5% |
| Fågelinfluensa H5N2 | Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough | 2500 | 15,5% |
- Mätt med qPCR som genomiska kopior / L
Tabell 2. Glasull koncentration av aviär influensavirus med vatten från fem platser i Alaska.
les/ftp_upload/3930/3930fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. Diagram av glasull bricka. Detta kan användas i stället för en hink, vilket sparar tid från sköljning. Begreppet liknar en glaspipett bricka.
Figur 2. Glasull filtrering med syra injektion av peristaltisk pump. Notera "T"-kontakt där pumpslang introducerar syra i provet linjen mellan vattenkranen och glasull filter. pH-justering är nödvändig endast om vattnet samplade har ett pH> 7,5.
Glasull filter är effektiva för att koncentrera patogena organismer från vatten med ett brett spektrum av grumlighetsnivåer och patogen densiteter (tabell 1). För att testa denna, var 20 liter deklorerat kranvatten blandas med torkad slam lerjord (0, 1,27, eller 2,75 g / L) för att uppnå den önskade nivån av grumlighet och såddes sedan med patogener vid olika densiteter. Vattnetfick passera genom en glasull filtret har de koncentrerade patogener i eluatet räknades, och detta värde var täljaren i procent återhämtning beräkningen. Den mängd av patogener ympade in i vattnet, dvs nämnaren i den procentuella återhämtningen beräkning, bestämdes genom att först ympa de patogena i en negativ eluat sedan att räkna upp patogener. Den negativa eluat framställdes genom att passera en oympade 20 liters prov genom ett filter och eluering. Kvantifiera de sådda patogener i en negativ eluat undviker skillnader i patogen uppräkning som kan uppstå matris skillnader som skapats av glasull filtret. Vikten av detta steg när kvantifiera patogener med qPCR diskuteras i Lambertini et al. 3. En 20 liters negativt kontrollprov koncentrerades via glasull filtrering för att bestämma var det inget inbyggt patogener närvarande som kunde förbrylla beräkningen procent återhämtning. En 10 ^ m nominell porstorlek förfilter viktsom används när grumlighet nivån var ≥ 215 NTU.
Poliovirus kvantifierades genom realtid qPCR med sekundära koncentrationen och nukleinsyra förfaranden utvinning och primers och prob beskrivs i Lambertini et al. 3. Kvantifierades i den slutliga koncentrerade provet volym (FCSV) skapad av sekundära koncentrationen förfarandet för poliovirus Cryptosporidium parvum . Oocyster visualiserades genom immunofluorescens (MeriFluor Cryptosporidium & Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, OH). Salmonella enterica kvantifierades i FCSV genom utstrykning på XLD-agar (Remel, Lenexa, KS) och räkna kolonibildande- enheter.
Glas ull filter är effektiva i att koncentrera aviära influensavirus (tabell 2). Låg patogenitet fågelinfluensaviruset (H5N2) ympades in i vattnet från ett flertal platser i Alaska och den procentuella återhämtningen beräknades såsom beskrivits above. Sekundär koncentration och nukleinsyra procedurer sura utfördes som för poliovirus, virus kvantifierades genom qPCR använda primers och prob som beskrivs i Spackman et al 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Glasullsprodukter filter har använts av flera forskargrupper 3,5,6 att koncentrera personella enteriska virus från olika vattenkällor som druckit vatten 7, grundvatten 8,9, ytvatten 10, havsvatten 11, avloppsvatten 12 och jordbruket avrinning 13. Här rapporterar vi filtren är också effektivt att koncentrera aviär influensa samt bakterie-och protozo patogener Salmonella enterica (serovar Typhimurium) och Cryptosporidium parvum, respektive. Deboosere et al. Också nyligen rapporterat glasull koncentration av aviär influensa 14.
Filtren är fördelaktiga genom att de är billiga, mycket bärbar, användbara i en rad olika vatten-matriser, och effektiva för att koncentrera många typer av vattenburna patogener. De kan konstrueras till valfri storlek, beroende på forskningsbehov. Efter desinficeraion, filterhus kan återanvändas.
Glas ull filter, behöver dock begränsningar. Som med alla viruskoncentration metod som bygger på electropositively laddade medier för virusadsorption (t.ex. 1MDS filter, CUNO Inc., Meriden, CT), beror filter effektivitet på omgivande vatten pH. I vårt laboratorium har vi valt pH 7,5 som cut-off, över vilken vattnet pH justeras nedåt genom att kontinuerligt pumpa 0,25 M HCl i filtret inmatningsraden under provtagning. Högre pH-vatten kan provtas utan pH-justering, men till priset av filter effektivitet 3. En annan begränsning är hållbarhetstiden. Vi har visat för filter som lagrats vid 4 ° C under sex veckor att patogen koncentrationen effektivitet inte minska (opublicerade data). Icke desto mindre har längre lagringstider inte testats så konservativt, för att säkerställa uppgifternas kvalitet vi inte använder filter äldre än 30 dagar. Vanligtvis är filter görs efter behov. En annan potentiell vägspärr i vissa countries är att erhålla glasull från den franska källan anges i tidigare artiklar. Nyligen visade vi standard obeklädda glasfiber isolering är lika effektivt, och detta är lätt tillgänglig från hårdvara eller byggvaruhus (se Material lista online).
För alla experiment är det viktigt att köra två uppsättningar kontroller, en utrustning tomma för att se glasullsprodukter filter inte förorenas under konstruktion och en återhämtning kontroll för att säkerställa att filtren fungerar som avsett. Dessa kontroller är nödvändiga för alla vattenburna patogener koncentrationen metod.
Använda ett filter av glasull kan vara så enkelt som kopplar den till en kran och vrida på kranen eller så komplicerat som provtagning ett sediment-lastad floden i en avlägsen plats, som kräver pumpar, pH-justering och ett förfilter för att förhindra igensättning. För vår forskargrupp, är den största fördelen med att använda filter glas ull förmåga att samla in och analysera tusentals vattenprovs för mänskliga och boskap patogener, vilket ger uppgifter om patogen förekomst och utbredning i miljön som inte skulle ha varit som möjligt med mer kostsamma och komplicerade metoder 13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar William T. Eckert för berätta videon. Utveckling av glasull protokollet var en del av Wisconsin vatten och hälsa Trial för enterisk risker (WAHTER Study), finansierat av US EPA STAR Grant R831630. Alaska togs av A. Reeves, A. Ramey och B. Meixell med ekonomiskt stöd från USGS. All användning av handel, produkt eller företag namn är beskrivande syfte och innebär inte godkännande av den amerikanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrochloric acid |  Fisher Scientific |
A144-500 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific |
BP359-212 | |
| Phosphate Buffered Saline Sodium chloride Potassium phosphate-dibasic Potassium phosphate-monobasic | Fisher Scientific |
BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| Sodium hypochlorite i.e., household bleach | Clorox |
||
| Sodium thiosulfate, anhydrous | Fisher Scientific |
S 475-212 | |
| Beef extract, desiccated | BD Biosciences |
211520 | |
| Glycine | Fisher Scientific |
G46-500 | |
| Oiled sodocalcic glass wool Or R-11 unfaced fiberglass insulation | Johns Manville |
Bourre 725 QN | |
| Polypropylene mesh | Industrial Netting |
xN4510 | |
| 2"x4" Sch 80 PVC threaded pipe nipple | Grainger |
6MW35 | |
| 2" Sch 40 PVC cap | Grainger |
5WDW3 | |
| Male adapter nylon fitting (1/2"x1/2") | US Plastic Corp. |
62178 | |
| Sample bottles for eluate- 1 liter | Fisher Scientific |
03-313-4F | |
| 60 mL syringe | Fisher Scientific |
NC9661991 | |
| pH strips | Whatman, GE Healthcare |
2614 991 | |
| Prefilter, Polypropylene, 10 inch cartridge, 10 μm | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Prefilter housing | Cole-Parmer | S-29820-10 |
References
- US Environmental Protection Agency. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. EPA 815-R-05-002. , (2012).
- Cashdollar, J. L., Dahling, D. R. Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water. J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).
- Lambertini, E. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996 (2008).
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. Report No. NC/99/40. , Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre. West Midlands, United Kingdom. (2000).
- Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., Vilaginés, R. Glass wool for virus concentration at ambient water pH level. Water Sci. Technol. 27, 299-306 (1993).
- Vivier, J. C., Ehlers, M. M., Grabow, W. O. Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res. 38, 2699-2705 (2004).
- Powell, K. L. Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges. Sililo, O. , Balkema, Rotterdam. 813-816 (2000).
- Hunt, R. J., Borchardt, M. A., Richards, K. D., Spencer, S. K. Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses. Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963 (2010).
- van Heerden, J., Ehlers, M. M., Heim, A., Grabow, W. O. Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J. Appl. Microbiol. 99, 234-242 (2005).
- Vilaginés, P. Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water. Water Sci. Technol. 35, 445-449 (1997).
- Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. J. Virol. Methods. 65, 265-271 (1997).
- Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Borchardt, M. A., Jokela, W. E., Spencer, S. K. American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, , (2011).
- Deboosere, N. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water. Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808 (2011).
- Lambertini, E. Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems. J. Water Health. 9, 799-812 (2011).
