Summary
筋萎縮性側索硬化症(ALS)のマウスモデルは、臨床的および行動的に検討されている。付随する免疫組織学的分析のための前提条件として、脊髄の調製は、詳細に描かれています。
Abstract
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は運動ニューロンの進行性変性をもたらす致命的な神経変性疾患である。発症のピークは散発的な疾患および家族性疾患のため50歳前後60歳前後である。その進行性の経過により、患者の50%は、発症から30ヶ月以内に死亡する。この病気のための新たな治療の選択肢を評価するために、ALSの遺伝子のマウスモデルは、そのようなSOD1(G93A)突然変異としてSOD遺伝子の人間の家族の変異に基づいて生成されています。モデルで評価しなければならない最も重要な側面は、全生存期間、臨床経過と運動機能があります。ここでは、臨床評価を示し、二つの行動モーターテストの伝導を示し、すべてのパラメータの定量的なスコアリングシステムを提供しています。 ALSモデルマウスの深さ分析の通常脊髄の免疫組織化学的検査を必要とするため、我々は何を適用する詳細にその準備を実証rsal椎弓切除術の方法。典型的な組織学的所見が実証されています。 ALSのモデルマウスの研究で示され検査法の包括的なアプリケーションは、研究者が確実に後でヒト臨床試験のための基礎を提供することができ、将来の治療オプションをテストすることが可能になります。
Protocol
動物は、ジャクソン研究所(#002726)1から購入した。それらは臨床的に獲得し、運動機能(ロータロッド試験)と筋力(ワイヤ試験をぶら下げ)の試験に供されています。すべてのこれらの試験や動物の殺害後脊髄を準備するためには、動物実験の適正な実施のためのローカルガイドラインに非常に近くに基づき行われてきた。
1。臨床スコア
別に体重マウスの評価から以下の4点のスコアリングシステム2運動障害の兆候がないか調べられます:
4点:通常(運動機能障害の兆し)
3点:尾によって中断されたときに後肢の震えは明白です
2点:歩行異常が存在
1点:少なくとも一つの後肢のドラッグ
0点:対称麻痺自体右側にできない、または最大体重の20%の損失が、この場合には動物は直ちに安楽死させ、実験が終了した
2。運動機能のテストと筋力
ワイヤーハンギング
このテストは、筋力3、4を評価するために使用されています。すべての動物は、少なくとも1日か2日ロータロッドテストの後にこのテストを実行します。各マウスは0.8 cmの間隔でカスタムメイドの線の蓋の上に置き、慎重に逆さまになっている、藁上に60 cmの底部を覆った。少なくとも180秒の3回連続しての訓練の後に落ちるように遅延が測定されます。各マウスは、180秒の最大かつ最長の期間が記録されているため、反転蓋を保持するには、次の3つの試行までに与えられます。
ロータロッドテスト
3、4を用いて測定した。優れた性能は感覚調整の高い学位を必要とします。マシンがテストされた動物の気を散らす刺激を避けるために、穏やかな、非妨害環境に配置する必要があります。それはコンピュータ制御のモーター駆動回転スピンドルと5匹のマウスのための5つのレーンで構成されています。マウスの滝は下部のプラスチック板に圧力を自動的に検出されます。 15 rpmの一定速度で少なくとも180秒の3回連続しての訓練後、動物は回転棒上に残ることができるの時間が測定されます。各動物は、3つの試験と立ち下がりが記録されずに長い待ち時間を受ける。運動協調性に有意差の大半がこの時間枠内で検出されているため、180秒の時間がカットオフ時間として選択されます。
3。脊髄の準備
- 動物は、地元のガイドラインに従い、CO 2吸入によって殺されており、すぐに4%パラホルムアルデヒド溶液、続いてPBS溶液でtranscardially灌流されています。
- 犠牲にマウスの脊髄を準備するために、動物は、操作テーブルの上に配置され、四肢は、マウスの裏面を露出させるために側に固定されています。
- 70%エタノール溶液で短い洗浄は、解剖部位をきれいにし、髪のコートを平坦化します。
- その後、皮膚は正中線に鋭いメスで切開されています。皮膚を切る容易にするために両側に延伸される。脚の筋肉が準備されなければならない場合は、その皮膚が切開されることもあります。
- 皮膚切開が完了したら、それはボディの基本的な表在筋膜を露出させるピンセットで脇にプルアップされています。
- 首の筋肉と項靱帯を除去しなければならないとCAです。refully用意しました。深く病変脊髄に切開しないように注意してください。肩の筋肉にも優れた脊柱を露出させるために削除することができます。
- その後、傍脊柱筋全体脊柱から削除されます。
- 脊柱を開くためには、いくつかのlaminectomiesは、実行する必要があります。一つは、環椎後頭関節のサイトで上位脳神経の部分から開始する必要があります。
- 上部の2肢の固定を削除し、最初の脊椎の椎弓切除を行うことが良いことができるように首を引き伸ばし過ぎるのが最も簡単です。これらが露出し脊髄に触れずに引き離されています。
- 多くの脊椎は、最初の角度をハサミで両側に脊椎のアーチをtransectingし、背側のプロセスに引いて削除されます。椎骨の残りの側面部分は脊髄の後の完全な除去を容易にするために削除する必要があります。
- 腰部脊椎の解剖学的ランドマークlのコードはまた、頚部脊髄に存在して腫れることがあります。
- 全体脊髄の椎弓切除を終え、あなたもすべての腹根を横断すると髄膜の硬膜から脊髄を解放することを確認してください。
- その後、脊髄は頭側カットとは、脊髄を除去するために開始されています。
- 最後に、脊髄も完全に解放される遠位馬尾·馬尾で切断されています。
- 最終的に、脊髄を一晩postfixating溶液(例えば4%パラホルムアルデヒド)に配置され、さらに処理することができます。我々は通常、免疫組織学的解析のためにそれを準備する脊髄凍結切片。
4。代表的な結果
脊髄の準備のテクニックは、このビデオの記事の焦点を表しています。これは後に組織切片のために、最終的には脊椎の免疫組織学的解析のために必須の前提条件です。lのコードのセクションを参照してください。最終結果の一例として、野生型マウスの腰部脊髄(WT)およびSOD G93Aトランス(TG)マウスの前角領域の免疫組織化学的後処理が実証されています。運動ニューロンは、一次抗ChATの抗体および二次Cy3標識抗体を用いて、後続の蛍光標識を識別することができます。さらに、DAPI(4,6 -ジアミジノ-2 -フェニル)核カウンター染色( 図1)が実行されています。
図1抗ChATの抗体(赤)と野生型(WT)マウスの腰部脊髄前角(左側)とのDAPI(青)による細胞核のカウンター染色と運動ニューロンの免疫を可視化する蛍光顕微鏡SOD G93Aトランスジェニック(Tg)(右)130日齢のマウス。スケールバー:40μm以下。
の免疫組織化学的分析などSOD G93Aマウスは、この記事のプライマリスコープではありませんこれらのトランスジェニックマウスが特徴づけられているた元の出版物、さらに、参照1、5、6のために治療法を勉強し、より最近のものを参照してください。治療効果が明確に定義された免疫組織学的レベルで区別されなければならない場合、定量的な評価アルゴリズムは、立体的なソフトウェア(例えば、7を参照)でサポートされて適用されるべきである。
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Discussion
SOD1(G93A)の遺伝的マウスモデルはヒトの筋萎縮性側索硬化症8に匹敵する進歩的な運動ニューロン損失の疾患経過を研究する貴重な動物モデルである。異なる治療パラダイムの様々なこのモデルでは評価され、後で人間の臨床試験8-10にテストするための基礎を表すされています。これらのマウスの実験的治療の研究では有意差を検出することができるようにするためには、少なくとも24リットルをマッチさせた男女のバランスと同じ遺伝的背景のマウスが含まれており、二重盲検デザイン8に従うように著名な重要である。人間の臨床試験に匹敵する、単一の均一なエンドポイントの基準を選択する必要があります。ここでは、最も一般的に使用されるものは、その側に配置された後、30秒後にそれ自体を右に動物のことができないことである。この基準に達した場合、動物が犠牲にされ、そのライフタイムは、生存率の時間として記録されます。
TreatmeNT研究は、発症前の臨床状態で起動することができます(生活の日(DOL)で、例えばDOL 30 50または偶数)の動物はまだ運動機能障害の兆候を示さないと我々の臨床スコアリングシステムの4点で採点される。もう一つの可能性は、最初の臨床症状が表示され、動物が尾によって中断されたときに後肢の震えが明らかである場合開始する必要が対症療法的なアプローチで構成されています。これは、疾患発症として定義されており、この初期の病期は臨床スコア3と評価されている。運動機能および筋力のテストで重要な障害は、主にのみ以上の二から四週間後に発生します。の平均動物がDOL約80最初の臨床病期に達すると、一部の研究者はシンプルなアプローチでこの時点ですべての動物のためにそれらの症状の治療を開始します。両方の設定では、疾患の進行を監視することが義務付けられています。これはpresympの治療開始時に開始すべきであるtomatically対症療法動物用の動物(DOL 50またはDOL 30、それぞれ)、またはDOL 70を処理した。疾患の進行のモニタリングは、体重、臨床神経学的スコアリングと運動機能と筋力のテストの週2回の測定が含まれています。動物は臨床スコア1(少なくとも一つの後肢のドラッグ)に達するならば、我々は臨床スコアの0点を逃さないために体重と臨床モニタリングの毎日の測定を実行することをお勧めします(対称麻痺、自分自身の権利または20の損失のないこと最大体重の%)動物は直ちに安楽死させなければならないと実験が終了します。それは初めての審査官はまた、進行の微妙な臨床徴候を検出するのに役立ち、経験豊富な動物の研究者によって導かれることをお勧めします。 Weydt ら 2の後の臨床4点スコアリングシステムは、現場に設立され、明確に区別することができる基準を使用して、信頼性の高いシステムです。 A臨床症状のより微妙な分化は、それほど明確でなくて、非常に審査官に依存するだろう。
行動の障害を検出するためにテストパラダイムの様々な利用可能です。ほとんどの著者は、回転シリンダ4、11上で実行する動物の能力を評価するロータロッドテストを支持している。研究では、SOD1 G93Aマウスモデルで行動テストの意義を評価するロータロッドテストでは、11歳の16週目から早くも野生型とトランスジェニックマウスの間に有意差を検出するのに非常に敏感であることが判明した。可能な限りの修正は一定の速度または加速高速走行で実行されている含まれています。いずれにせよ、動物はいくつかの運動協調の基本的なレベルを得るために他のものよりも訓練が必要になる場合がありますので、最初の有効なテストの前に訓練する必要があります。制限は、このタスクを実行するには、異なった動機動物で表されます。ただし、これは少なくとも番目の繰り返しテストで補償することができます試験日あたりのREE回。初期の運動障害を検出するのに非常に敏感である別のモーター行動試験では、フットプリント分析11です。動物が彼らの足は、塗料の貯蔵中に浸漬した後、通路上で実行するように動機づけしなければならないしかし、それはかなり面倒です。フットプリントの品質が大きく変化することができ、ソフトウェア支援分析は困難である。したがって、我々は運動協調性の評価のためのロータロッドテストを好む。
ハンギングワイヤーテストでは、手足の筋力を評価した。それは最高の数週間病の4開始後早期に筋肉の障害を検出し、むしろ原油テストです。しかし、それは実行するために非常に簡単で、全体の試験装置を容易に構築することができます。筋力のために、より精巧なテストでは、力変換器12の使用です。ここで、マウスは、その後ろ足またはその前面のいずれかで力変換器に接続されているバーをつかむためにプロンプトが表示されます足。考慮しなければならない他の機能テストは、実行中の車輪間距離の測定、あるいはオープンフィールド活動3の評価は、13が含まれています 。しかし、我々の経験ではロータロッドと接続先のないワイヤのテストの組み合わせは、SOD1 G93Aマウスの評価のための簡単に実用的と時間を効率的に、最も敏感であることが判明した。全体的に、動物での前臨床試験は非常に慎重に設計されるべきであり、CONSORTガイドライン(で説明したように人間の臨床試験の基本的な原則に従うべきであるwww.consort-statement.org )14。だけにして、臨床研究のための動物の使用が正当化することができ、その結果は、最終的に人間の臨床応用への変換が成功につながる可能性があります。
これらの臨床的および行動の結果は、常に脊髄モトを含む神経筋単位の病態の解析に相関させる必要がありますニューロン、軸索と神経筋接合部14。ここでは、中枢神経系、脊髄病変の高品質な分析は、生存率や病気の進行に効果の解釈の前提条件となります。徹底した組織の固定が重要であるため、PBS-溶液の入った4%パラホルムアルデヒドを持つ動物の血はよく標準化されるべきである。慎重に解剖テーブル脊髄を除去できるようにするためには、固定手術用顕微鏡、微細手術器具と一緒にインストールする必要があります(下の手術器具のリストを参照してください)可能である必要があります。脊髄全体が削除された後、適切なセクショニング法(例えばビブラトームまたはcryotome)に処理することができ、最終的に免疫分析に供することができる。ここでは、基本的な評価パラメータは、脊髄の運動ニューロンとアクティブ化または浸潤グリア細胞10、15の番号です。オリジナルの研究課題に応じて、追加の免疫組織化学メートルSODを集約または中枢神経系の内皮の整合性のようなarkersを評価することができます。さらに、末梢神経系疾患の病理学は、末梢神経軸索のと神経筋接合部の試験により評価することができる。唯一のCNSとPNSの臨床的および免疫組織化学的分析の両方の組み合わせは、臨床所見と相関する必要があります全体的なALSの病理学の完全なビューを提供します。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
LTは、大学医学部ゲッティンゲンForschungsförderungsprogrammから助成金を受けています。 PLとMBは脳の分子生理学(CMPB)、ゲッティンゲンのためのDFG研究センターによってサポートされていました。著者らは、オーディオとビデオ編集のヘルプのためのビデオ撮影とビルギットLiebauの支援については博士ラースTatenhorstに感謝します。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
Hanging wire device | Custom Made | ||
Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
“Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).