Medicine

בדיקה קלינית הסרת חוט השדרה במודל של עכברים של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS)

Published: March 17, 2012 doi: 10.3791/3936

René Günther¹, Martin Suhr¹, Jan C. Koch¹, Mathias Bähr^1,2, Paul Lingor^1,2, Lars Tönges¹

¹Dept. of Neurology, University Medicine Göttingen, ²DFG Research Center for the Molecular Physiology of the Brain (CMPB), Göttingen, Germany

Summary

במודל של עכברים של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) נבחן קלינית התנהגותית. כתנאי ניתוח immunohistological נלווה להכנת חוט השדרה מתואר בפירוט.

Abstract

טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) היא מחלת ניוון עצבים קטלנית והתוצאה היא ניוון הדרגתי של motoneurons. השיא של התפרצות הוא סביב 60 שנה למחלה סדירה סביב 50 שנה למחלה משפחתית. בעקבות הקורס המתקדם שלה, 50% מהחולים מתים תוך 30 חודשים של תחילת הסימפטומים. על מנת להעריך אפשרויות טיפול חדשות למחלה זו, מודלים העכבר הגנטיים של ALS נוצרו על בסיס מוטציות משפחתיות האדם בגן SOD, כמו מוטציה SOD1 (G93A). ההיבטים החשובים ביותר שיש הערכה במודל הם בסך הכל, הישרדות כמובן קלינית בתפקוד המוטורי. הנה, אנחנו מדגימים את הערכה קלינית, להראות ההולכה של שתי בדיקות רכב התנהגותיים ולספק מערכות הבקיע כמותיים על כל הפרמטרים. כי בניתוח מעמיק של המודל העכבר ALS בדרך כלל דורש בדיקה immunohistochemical של חוט השדרה, אנחנו מדגימים את הכנתה בפירוט החלת לעשותlaminectomy rsal השיטה. הממצאים היסטולוגית למופת הם הפגינו. יישום מקיף של שיטות הבדיקה המתואר מחקרים על מודל עכברים של ALS יאפשר חוקר באופן אמין לבחון אפשרויות טיפוליות עתידיות אשר יכול לשמש בסיס ניסויים קליניים בבני אדם אחר כך.

Protocol

בעלי חיים נרכשו מ ג'קסון המעבדה (# 002726) ^1. הם קלעו קלינית נתון הבדיקה של המנוע הפונקציה (rotarod מבחן) ושל כוח השרירים (תלוי במבחן תיל). כל הבדיקות האלה לבין הרג של בעלי חיים מאוחר יותר, על מנת להכין את חוט השדרה בוצעו בהתאם קרוב מאוד ההנחיות מקומיים לניהול נכון של ניסויים בבעלי חיים.

1. ציון קלינית

מלבד הערכה של עכברים משקל הגוף נבחנים סימנים של הגירעון מנוע עם מערכת הנקודה הבאה 4 הבקיע ^2:

4 נקודות: רגילות (שום סימן של חוסר תפקוד המנוע)

3 נקודות: רעד בגפיים האחוריות ניכרים כאשר תנאי בזנבו

2 נקודות: הפרעות בהליכה נוכחים

1 נקודה: גרירה של איבר אחד לפחות האחורית

0 נקודה: סימטרי , שיתוק וחוסר יכולת הזכות עצמה או הפסד של 20% ממשקל הגוף לכל היותר, במקרה זה את בעלי החיים מומתים מיד את הניסוי הסתיים

2. בדיקות של תפקוד מוטורי וכוח שרירים

תלוי חוט

בדיקה זו משמשת להערכת כוח שרירי ^{3, 4.} כל בעלי החיים לבצע את הבדיקה לפחות יום או יומיים לאחר הבדיקה rotarod. כל העכבר ממוקם על המכסה מחוייט עם חוט במרווחים של 0.8 ס"מ ובזהירות התהפך, 60 ס"מ מעל קש מכוסה התחתונה. אחרי האימון במשך שלוש פעמים רצופות של לפחות 180 של חביון ליפול נמדד. עכבר זה ניתנת עד שלושה ניסיונות לקיים על מכסה הפוך לתקופה מקסימלית של 180 וה התקופה הארוכה ביותר נרשם.

Rotarod מבחן

s = "jove_content"> מנגנון rotarod (אוגו באזיל, Comerio, איטליה) שימש למדידת בתיאום המנוע, איזון המנוע יכולת הלמידה ^{3, 4.} ביצועים טובים דורש רמה גבוהה של תיאום הסנסורית. המכשיר צריך להיות ממוקם בסביבה שלווה ולא מטרידה, כדי למנוע גירויים distractive עבור בעל החיים נבדק. הוא מורכב ציר המנוע מונע מבוקרת מחשב מסתובב וחמישה נתיבים חמש עכברים. פולס של העכברים מזוהים אוטומטית על צלחת פלסטיק בחלק התחתון של לחץ. אחרי האימון במשך שלוש פעמים רצופות של של לפחות 180 במהירות קבועה של 15 סל"ד הזמן שבו בעלי חיים יכול להישאר על מוט מסתובב נמדד. כל חיה עוברת שלושה ניסיונות ההשהיה הארוכה ביותר בלי ליפול נרשם. בזמן של 180 נבחר זמן גיזום ', כי רוב הבדלים משמעותיים תיאום מנוע מזוהים במסגרת הזמן הזה.

3. חוט השדרה הכנה

בעלי חיים נהרגים על ידי הפחה ₂ CO בהתאם להנחיות המקומיות ושהם perfused מיד transcardially פתרון PBS ואחריו פתרון paraformaldehyde 4%.
על מנת להכין את חוט השדרה של העכבר הקריב, חיה ממוקם על שולחן הניתוח ואת ארבעת הגפיים קבועים בצד כדי לחשוף את הצד האחורי של העכבר.
כביסה קצר עם פתרון אתנול 70% מנקה את האתר של דיסקציה ומשטחת את המעיל שיער.
לאחר מכן העור חקוק באיזמל חד של הקו החציוני. על מנת להקל על חיתוך העור נמתח על שני הצדדים. אם שרירי הרגליים יהיה מוכן, העור שלהם גם להיות חקוק.
לאחר חיתוך העור הושלמה, הוא הסיט עם זוג פינצטה לחשוף fascia השטחית הבסיסית של הגוף.
שרירי הצוואר רצועה עורפית צריך להסיר והם CAמוכן refully. היזהר שלא לחתוך את חבל הטבור עמוק פגיעה בעמוד השדרה. שרירי הכתף ניתן גם להסיר על מנת לחשוף טוב יותר את עמוד השדרה.
אז השרירים paravertebral יוסרו עמוד השדרה כולו.
על מנת לפתוח את laminectomies עמוד השדרה כמה צריך להתבצע. יש להתחיל מהחלק העליון גולגולתי באתר של מפרק atlanto-העורפית.
זה הכי קל להסיר את קיבוע של שתי גפיים עליונות ו להתמתח יתר על המידה את הצוואר כדי להיות מסוגל יותר לבצע את laminectomy חוליות 1. אלה התרחקה בלי לגעת בחוט השדרה חשוף צוואר הרחם.
חוליות יותר יוסרו על ידי 1 חוצים את קשתות בחוליות בשני הצדדים עם מספריים בזווית ואז מושך את התהליכים הגב. חלקים לרוחב הנותרים של החוליות יש להסיר כדי להקל מאוחר יותר הסרה מלאה של חוט השדרה.
ציון דרך האנטומי של שדרה מותניכבל אני הוא עבוי כי נוכחת גם חוט השדרה הצווארי.
כשסיים laminectomy של חוט השדרה כולו, ודא כי אתה גם transect כל השורשים הגחון ולשחרר את חוט השדרה של מאטר דורה של קרומי המוח את.
אז חוט השדרה הצווארי הוא חתך cranially ואתה מתחיל להסיר את חוט השדרה.
לבסוף חוט השדרה הוא חתך גם דיסטלי cauda-equina להשתחרר לחלוטין.
בסופו של דבר, חוט השדרה ממוקמת בפתרון postfixating (paraformaldehyde למשל 4%) במשך הלילה יכול להיות מעובד יותר. בדרך כלל אנחנו cryosection חוט השדרה להכין אותו לניתוח immunohistological.

4. נציג תוצאות

הטכניקה של הכנת חוט השדרה מהווה את המוקד של מאמר זה וידאו. זהו תנאי הכרחי חתך ברקמת מאוחר יותר, ובסופו של דבר לניתוח immunohistological של ספינהחוט וסעד חלקים. כדוגמה התוצאה הסופית, הבדיקות immunohistochemical האזור הקרן הקדמית של חוט השדרה המותני של העכבר wildtype (WT) של SOD G93A transgene (TG) העכבר באה לידי ביטוי. הנוירונים המוטוריים ניתן לזהות נוגדנים נגד דברו הראשי וסימון ניאון לאחר מכן עם נוגדנים Cy3 משני. בנוסף, גרעיני נגד כתם עם DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) שבוצעה (איור 1).

באיור 1. Photomicrographs פלורסנט חזותי immunodetection של motoneurons עם נוגדן אנטי דברו (אדום) ואת גרעין הסלולר נגד כתם ידי DAPI (כחול) קרן חוט השדרה המותני העכבר הקדמי של wildtype (ט) (משמאל) ושל SOD G93A מהונדס (TG) (מימין) העכבר בגיל 130 ימים. סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר.

כמו ניתוח immunohistochemical שלאת SOD בעכברים G93A אינו היקף העיקרי של מאמר זה יש לפנות את הפרסום המקורי, שבו אלה העכברים הטרנסגניים אופיינו ואת אלה האחרונים יותר, ללמוד גישות טיפוליות לעיון נוסף ^{1, 5, 6.} אם השפעות טיפוליות יהיו מובחנים ברמה immunohistological מוגדר אלגוריתמים הערכה כמותית יש להחיל נתמך על ידי תוכנת stereological (לדוגמה לראות ^7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המודל (G93A) SOD1 העכבר הגנטי הוא מודל בעל חיים בעל ערך לחקור את מהלך המחלה של אובדן motoneuron מתקדמת להשוות טרשת האנושי לרוחב amyotrophic ^8. מגוון של פרדיגמות טיפול שונות הוערכו במודל זה ולייצג הבסיס לאחר מכן לבצע בדיקה קלינית ^8-10 מחקרים בבני אדם. כדי להיות מסוגל לזהות הבדלים משמעותיים במחקר טיפול ניסיוני בעכברים אלו, יש חשיבות הנודע לכלול לפחות 24 גורים בהתאמה מגדרית מאוזנות עכברים בעלי רקע גנטי זהה ופעל עיצוב כפול עיוור ^8. להשוות מחקרים קליניים בבני אדם, קריטריון אחד נקודת הסיום אחיד יש לבחור. הנה, זו הנפוצה ביותר היא חוסר היכולת של בעל החיים ימינה עצמה בתוך 30 שניות לאחר שיוצבו על צדו. אם הקריטריון הוא הגיע בעל החיים הוא הקריב את זמן החיים שלו נרשמת הזמן של הישרדות.

Treatmeמחקרים-NT ניתן להתחיל במצב קליני presymptomatic (למשל ביום של החיים (דול) 50 או אפילו על דול 30), כאשר בעלי החיים עדיין אינם מפגינים שום סימן של חוסר תפקוד המנוע והוא יהיה קלע עם 4 נקודות במערכת הניקוד הקליני שלנו . אפשרות אחרת כוללת בגישה לטיפול סימפטומטי אשר אמור להתחיל כאשר הסימפטום הקליני הראשון מופיע רעידות הגפיים האחוריות ניכרים כאשר בעל החיים מושעה בזנבו. זה מוגדר הופעת המחלה וזה שלב המחלה הראשונית מדורגת עם ציון קליני 3. ליקויים משמעותיים בדיקות של תפקוד מוטורי של כוח השרירים בעיקר להתרחש רק יותר משניים עד ארבעה שבועות לאחר מכן. כפי בממוצע החיות מגיעים לשלב 1 מחלה קלינית סביב דול 80, כמה חוקרים להתחיל טיפול סימפטומטי שלהם לבעלי חיים כל הזמן בשלב זה בגישה פשוטה. בשתי סביבות אלו הוא חובה לעקוב אחר התקדמות המחלה. זה יש להתחיל בזמן התחלת הטיפול presympטיפול tomatically בעלי חיים (50 דול דול או 30, בהתאמה) או דול 70 עבור חיות שטופלו סימפטומטית. מעקב אחר התקדמות המחלה כוללת קביעת פעמיים בשבוע ממשקל הגוף, הניקוד נוירולוגית קלינית בדיקות של תפקוד מוטורי וכוח השרירים. אם בעלי החיים להגיע ציון קליני 1 (גרירה של איבר אחד לפחות אחורית) מומלץ לבצע מדי יום קביעת משקל גוף וניטור קליני כדי לא לפספס את הציון הקליני 0 נקודה (שיתוק סימטרי, חוסר יכולת הזכות עצמה או הפסד של 20 % ממשקל הגוף לכל היותר), כאשר בעלי החיים צריכים להיות מורדמים מיד את הניסוי הסתיים. מומלץ בוחן לראשונה מונחה על ידי חוקר בעל חיים מנוסה, מסייעת לזהות גם סימנים קליניים קלים של התקדמות. קליני 4 נקודה הניקוד המערכת לאחר Weydt ואח' ² היא מבוססת היטב בתחום, היא מערכת אמינה באמצעות קריטריונים אשר יכול ליצור הבדל ברור.הבחנה עדינה יותר של סימפטומים קליניים יהיה ברור פחות תלויה מאוד הבוחן.

על מנת לאתר ליקויים התנהגותיים מגוון של פרדיגמות הבדיקה זמין. רוב החוקרים מעדיפים את הבדיקה rotarod מעריכה את היכולת של בעל חיים כדי לרוץ על גליל מסתובב ^{4, 11.} במחקר להערכת המשמעות של בדיקות התנהגותיות במודל העכבר SOD1 G93A מבחן rotarod הוכיח שהוא רגיש מאוד לזהות הבדלים משמעותיים בין wildtype ואת העכברים הטרנסגניים כבר משבוע 16 של עידן ב ^11. שינויים אפשריים כוללים פועל במהירות קבועה או לרוץ במהירות מואצת. בכל מקרה, בעלי החיים, יש לעבור הכשרה לפני הבדיקה תקפה 1 כי חלק עשוי להזדקק הכשרה יותר מאחרים כדי להשיג רמה בסיסית של תיאום המנוע. הגבלה מיוצג על ידי בעלי חיים בעלי מוטיבציה אחרת כדי לבצע משימה זו. עם זאת, ניתן פיצוי על ידי בדיקות חוזרות ונשנות של ה לפחותרי פעמים ביום הבחינה. עוד מבחן התנהגותי המנוע שהוא רגיש מאוד באיתור ליקויים מוטוריים המוקדמים הוא ניתוח טביעת הרגל ^11. עם זאת, מייגע למדי, כי החיות יש מוטיבציה לדרוס את הגמלה לאחר רגליהם טבל מאגר של צבע. איכות של טביעת הרגל יכול להשתנות במידה רבה ו ניתוח בעזרת תוכנה קשה. לכן, אנו מעדיפים את הבדיקה rotarod להערכת תיאום מנוע.

מבחן תיל תלויים העריכו כוח השרירים של הגפיים. זהו מבחן גולמי ולא בצורה הטובה ביותר מזהה גירעונות שרירים מוקדם כמה שבועות לאחר תחילת המחלה ^4. עם זאת, קל מאוד לבצע את מנגנון הבדיקה כולה ניתן לבנות בקלות. מבחן משוכלל יותר כוח השרירים הוא השימוש מתמר כוח ^12. כאן, עכבר מתבקש לתפוס את בר מחובר מתמר כוח עם או האחוריות או הקדמי שלההכפות. בדיקות פונקציונליות אחרים שיש לשקול לכלול את מדידת המרחק גלגל ריצה או אפילו הערכה של הפעילות בשדה פתוח ^{3, 13.} עם זאת, מניסיוננו שילוב של rotarod ואת הבדיקה חוט תלוי הוכיח שהוא רגיש ביותר, מבחינה מעשית בקלות זמן יעיל להערכה של SOD1 לעכברים G93A. באופן כללי, מחקר קליני בבעלי חיים צריך להיות מתוכנן בקפידה, ועליה לפעול על עקרונות היסוד של כמה ניסויים קליניים בבני אדם כמתואר בהנחיות להתרועע ( www.consort-statement.org ) ^14. רק אז, השימוש בבעלי חיים למחקר קליני יכולה להיות מוצדקת והתוצאות יכולות להביא בסופו של דבר תרגום מוצלח ליישום קליניים בבני אדם.

ממצאים אלה קליניים והתנהגותיים תמיד צריך להיות מתואם לניתוח של הפתולוגיה של היחידה התוקפת כולל חוט השדרה Motoתא עצב, האקסון ו neuromuscular לצומת ^14. הנה, ניתוח איכותי של מערכת העצבים המרכזית בחוט השדרה הפתולוגיה היא תנאי הכרחי פרשנות של תופעות בהישרדות או התקדמות המחלה. בגלל הקיבעון רקמות יסודית היא קריטית, טפטוף של בעלי החיים עם paraformaldehyde 4% המכיל PBS-הפתרון צריך להיות תקנית גם כן. כדי להיות מסוגל להסיר בזהירות את חוט השדרה שולחן לנתיחה צריך להיות מותקן יחד עם מיקרוסקופ ניתוח ומכשירי ניתוח קבוע בסדר צריך להיות זמין (ראו רשימה של מכשירי ניתוח בהמשך). אחרי חוט השדרה כולו הוסר, זה יכול להיות מעובד לטכניקה חתך המתאים (למשל vibratome או cryotome) והוא יכול סוף סוף להיות חשוף ניתוח immunohistological. כאן, הפרמטרים ההערכה הבסיסיים הם המספרים של motoneurons בעמוד השדרה ותאי גלייה פעיל או חדירה ^{10, 15.} בהתאם לשאלת המחקר המקורי, מ 'immunohistochemical נוסףarkers כמו אגרגטים SOD או CNS שלמות האנדותל ניתן להעריך. יתר על כן, מחלת עצבים היקפית מערכת הפתולוגיה ניתן להעריך על ידי בדיקה של אקסונים העצב ההיקפיים של צמתים התוקפת. רק שילוב של ניתוחים הן קליניים immunohistochemical של מערכת העצבים המרכזית ו PNS לספק מבט מעמיק הכולל מחא הפתולוגיה שיש בקורלציה עם ממצאים קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

LT קיבלה תמיכה מענק Forschungsförderungsprogramm של רפואה באוניברסיטת גטינגן. PL ו MB נתמכו על ידי המרכז למחקר DFG על פיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CMPB), גטינגן. המחברים מודים לד"ר לארס Tatenhorst לעזרה עם videography ו בירגיט ליבאו עזרה עם אודיו עריכת וידאו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rota-Rod for Mice	Ugo Basile	# 47600
Hanging wire device	Custom Made
Operation Table Operation lamp Protective gloves
“Iris” Scissors, angled to side	Fine Science Tools	14063-09
Cohan-Vannas Spring Scissors, straight	Fine Science Tools	15000-10
Micro forceps	Hammacher, Solingen, Germany	HWC 111-10
Scalpel “präzisa plus”	Dahlhausen, Köln, Germany	11.000.00.510, FIG 10