Summary
Un modèle de souris pour la sclérose latérale amyotrophique (SLA) est un examen clinique et comportemental. Comme condition préalable à une analyse qui l'accompagne immunohistologique la préparation de la moelle épinière est représentée en détail.
Abstract
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est un trouble neurodégénérative mortelle entraînant une dégénérescence progressive des motoneurones. Pic d'apparition est d'environ 60 ans pour la maladie sporadique et autour de 50 ans pour la maladie familiale. En raison de sa marche progressive, 50% des patients meurent dans les 30 mois à compter de l'apparition des symptômes. Afin d'évaluer les options thérapeutiques pour cette maladie, les modèles génétiques de souris de la SLA ont été générés sur la base de l'homme mutations familiales dans le gène SOD, tels que la SOD1 (G93A) mutation. Les aspects les plus importants qui doivent être évaluées dans le modèle sont la survie globale, l'évolution clinique et la fonction motrice. Ici, nous démontrons l'évaluation clinique, montrent la conduction de deux essais de moteurs comportementaux et fournir des systèmes de notation pour tous les paramètres quantitatifs. Parce que une analyse en profondeur du modèle de souris SLA nécessite habituellement un examen immunohistochimique de la moelle épinière, nous démontrons sa préparation en détail l'application de la faireméthode laminectomie rselle. Des exemples de résultats histologiques sont mises en évidence. L'application complète des méthodes d'examen décrits dans les études sur le modèle murin de la SLA permettra au chercheur de tester de manière fiable les futures options thérapeutiques qui peuvent fournir une base pour plus tard les essais cliniques humains.
Protocol
Les animaux ont été achetés auprès de Jackson Laboratory (# 002726) 1. Ils sont cliniquement marqué et soumis à un test de la fonction motrice (rotarod test) et de la force musculaire (test du fil suspendu). Tous ces tests et la mise à mort plus tard des animaux en vue de préparer la moelle épinière ont été effectuées conformément à proximité immédiate des lignes directrices locales pour le bon déroulement de l'expérimentation animale.
1. Score clinique
Outre l'évaluation pour les souris de poids corporel sont les signes de déficit moteur avec les 4 suivants système de notation, point 2:
4 points: normal (aucun signe de dysfonctionnement moteur)
3 points: tremblements des membres postérieurs sont évidents quand il est suspendu par la queue
2 points: anomalies de la démarche sont présents
1 point: en faisant glisser d'au moins un membre postérieur
0 point: symétriquela paralysie, l'incapacité de droit lui-même ou la perte de 20% du poids maximal du corps, dans ce cas, les animaux sont euthanasiés immédiatement, et l'expérience est terminée
2. Tests de la fonction motrice et la force musculaire
Suspendu en fil métallique
Ce test est utilisé pour évaluer la force musculaire 3, 4. Tous les animaux d'effectuer ce test au moins un ou deux jours après le test rotarod. Chaque souris est placé sur un couvercle métallique sur mesure avec des intervalles de 0,8 cm et avec précaution à l'envers, 60 cm au-dessus d'une paille recouverte de fond. Après une formation de trois fois consécutives d'au moins 180 s le temps de latence de tomber est mesurée. Chaque souris est livrée à trois tentatives de tenir sur le couvercle inversé pour un maximum de 180 s et la plus longue période sont enregistrés.
Rotarod test
3, 4. Une bonne performance exige un degré élevé de coordination sensori-motrice. La machine doit être placé dans un environnement calme et non-inquiétant pour éviter les stimuli distractive pour l'animal testé. Il se compose d'un ordinateur contrôlé par broche entraînée par moteur rotatif et cinq voies pour cinq souris. Chutes des souris sont détectés automatiquement par pression sur une plaque en matière plastique au fond. Après une formation de trois fois consécutives d'au moins 180 s à une vitesse constante de 15 rpm, le temps pour lequel un animal peut rester sur la tige de rotation est mesurée. Chaque animal subit trois essais et la plus longue latence sans tomber est enregistrée. Le temps de 180 s est choisi comme seuil de temps parce que la majorité des différences significatives dans la coordination motrice sont détectés dans ce laps de temps.
3. Préparation de la moelle épinière
- Les animaux sont tués par l'insufflation de CO 2 en conformité avec les directives locales et sont immédiatement perfusé avec une solution PBS transcardiaque suivie par une solution de paraformaldéhyde à 4%.
- Afin de préparer la moelle épinière de la souris sacrifiée, l'animal est placé sur une table d'opération et les quatre branches sont fixées sur le côté de manière à exposer la face arrière de la souris.
- Un lavage court avec une solution d'éthanol à 70% nettoie le site de la dissection et aplatit le poil.
- Ensuite, la peau est incisée avec un scalpel dans la ligne médiane. Afin de faciliter la coupe de la peau est tendue des deux côtés. Si les muscles des jambes doivent être préparés, leur peau doit également être incisés.
- Après l'incision de la peau est terminée, il est tiré sur le côté avec une paire de pincettes pour exposer le fascia sous-jacent superficielle du corps.
- La musculature de la nuque et le ligament nucal doivent être enlevés et sont carefully préparée. Veillez à ne pas inciser profondément et à une lésion de la moelle épinière. Les muscles de l'épaule peut également être retiré afin de mieux exposer la colonne vertébrale.
- Puis les muscles paravertébraux sont retirés de la colonne vertébrale ensemble.
- Afin d'ouvrir les laminectomies la colonne vertébrale plusieurs doivent être effectuées. On devrait commencer à partir de la partie supérieure du crâne sur le site de l'articulation atlanto-occipitale.
- Il est plus facile d'enlever la fixation des deux membres supérieurs et du cou étirer à être mieux en mesure d'effectuer la laminectomie de la première vertèbre. Ceux-ci sont arraché sans toucher à la moelle épinière cervicale exposée.
- Plus les vertèbres sont enlevés d'abord sectionnant les arcs vertébraux des deux côtés avec des ciseaux à angle, puis en tirant sur les apophyses dorsales. Les autres parties latérales des vertèbres doivent être enlevées pour faciliter le retrait ultérieur complète de la moelle épinière.
- Un repère anatomique de la spina lombairecordon l est l'intumescence qui est également présent dans la moelle épinière cervicale.
- Après avoir terminé la laminectomie de la moelle épinière entière, assurez-vous que vous avez également transect tous les racines ventrales et de libérer la moelle épinière de la dure-mère des méninges.
- Ensuite, la moelle épinière cervicale est coupée en haut et en vous commencez à retirer la moelle épinière.
- Enfin la moelle épinière est également coupé à la queue-queue distale d'être complètement libéré.
- En fin de compte, la moelle épinière est placé dans une solution postfixating (paraformaldéhyde 4% par exemple) pendant la nuit et peuvent être traitées ultérieurement. Nous avons l'habitude Coupe à congélation de la moelle épinière pour le préparer pour l'analyse immunohistochimique.
4. Les résultats représentatifs
La technique de préparation représente la moelle épinière au centre de cet article vidéo. Il est une condition essentielle pour la coupe des tissus plus tard et, finalement, pour l'analyse immunohistochimique de spinacoupes de la moelle l. A titre d'exemple d'un résultat final, un bilan immunohistochimique de la région de la corne antérieure de la souris la moelle épinière lombaire d'un type sauvage (wt) et d'une SOD G93A transgène (tg) de la souris est démontrée. Les neurones moteurs peuvent être identifiés avec un primaire anti-ChAT anticorps et après marquage fluorescent avec un secondaire Cy3 anticorps. En outre, une centrale nucléaire contre-tache avec du DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole) a été réalisée (Figure 1).
Figure 1. Photomicrographies fluorescentes visualiser l'immunodétection des motoneurones avec des anti-ChAT anticorps (rouge) et les noyaux cellulaires contre-tache par DAPI (en bleu) chez la souris cordon corne lombaire antérieure d'un type sauvage (wt) (à gauche) et de une SOD G93A transgénique (tg) (à droite) de la souris à l'âge de 130 jours. La barre d'échelle: 40 um.
Comme l'analyse immunohistochimique deles souris G93A SOD n'est pas le champ d'application principal de cet article s'il vous plaît consulter la publication originale dans laquelle ces souris transgéniques ont été caractérisés et d'autres plus récents qui étudient des approches thérapeutiques pour davantage de référence 1, 5, 6. Si les effets thérapeutiques doivent être différenciées sur le plan immunohistochimique clairement défini des algorithmes d'évaluation quantitatives devraient être appliquées, financées par un logiciel stéréologique (voir par exemple 7).
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Discussion
La SOD1 (G93A) modèle de souris génétique est un modèle animal utile pour étudier la progression de la maladie de la perte progressive des neurones moteurs comparable à l'homme la sclérose latérale amyotrophique 8. Une variété de paradigmes différents traitements ont été évalués dans ce modèle et représentent une base pour plus tard dans l'essai de l'homme 8-10 études cliniques. Afin d'être en mesure de détecter des différences significatives dans une étude expérimentale de traitement chez ces souris, il est d'une importance éminente pour inclure au moins 24 litière adaptée équilibre entre les sexes souris de la même bagage génétique et de suivre un double-aveugle de conception 8. Comparable à des études cliniques humaines, un critère critère unique et uniforme devrait être choisi. Ici, la plus couramment utilisée est l'incapacité de l'animal à se redresser en 30 secondes après avoir été placé sur le côté. Si ce critère est atteint l'animal est sacrifié et sa durée de vie est enregistré comme temps de survie.
Treatmeétudes NT peut être démarré à un état pré-symptomatique clinique (par exemple au jour de la vie (DOL) 50 ou même sur DOL 30) lorsque les animaux ne sont pas encore présentent aucun signe de dysfonctionnement moteur et serait marqué avec 4 points de notre système de notation clinique . Une autre possibilité consiste en une approche un traitement symptomatique qui devrait commencer lorsque le premier symptôme clinique apparaît et tremblements des membres postérieurs sont évidentes lorsque l'animal est suspendu par la queue. Ceci est défini comme apparition de la maladie et de ce stade initial de la maladie est classé avec le score clinique 3. Des déficiences importantes dans les tests de la fonction motrice et de la force musculaire surviennent le plus fréquemment plus de deux à quatre semaines plus tard. Comme, en moyenne, les animaux atteignent le stade de la première maladie clinique autour de Dol 80, certains chercheurs commencent leur traitement symptomatique de tous les animaux à ce point dans le temps dans une approche simplifiée. Dans les deux paramètres, il est obligatoire de suivre la progression de la maladie. Cela devrait être lancé au moment de l'initiation du traitement pour presympmatiquement les animaux traités (DOL DOL 50 ou 30, respectivement) ou à DOL 70 pour les animaux traités de façon symptomatique. Suivi de la progression de la maladie comprend une détermination deux fois par semaine de poids corporel, clinique neurologique de notation et les tests de la fonction motrice et la force musculaire. Si les animaux atteignent le score clinique 1 (en faisant glisser d'au moins un membre postérieur), nous recommandons d'effectuer la détermination quotidienne de poids corporel et une surveillance clinique afin de ne pas manquer le score clinique 0 point (paralysie symétrique, l'incapacité de droit lui-même ou de la perte de 20 % du poids maximal du corps) lorsque les animaux doivent être euthanasiés immédiatement, et l'expérience est terminée. Il est recommandé que l'examinateur pour la première fois est guidé par un chercheur expérimenté qui animale permet de détecter également de subtiles signes cliniques de la progression. La clinique 4 de point de système de cotation après Weydt et 2 al est bien établi dans le domaine et est un système fiable en utilisant des critères qui peuvent être clairement différenciés. Unedifférenciation plus subtile des symptômes cliniques serait moins claire et très dépendante examinateur.
Afin de détecter les déficits comportementaux une variété de paradigmes d'essai est disponible. La plupart des auteurs préconisent le test rotarod qui évalue la capacité de l'animal afin de fonctionner sur un cylindre rotatif 4, 11. Dans une étude évaluant l'importance des tests de comportement dans le modèle de la souris SOD1 G93A le test rotarod s'est avéré être très sensible pour détecter des différences significatives entre de type sauvage et des souris transgéniques dès de la semaine 16 de l'âge sur 11. Modifications possibles sont en cours d'exécution à une vitesse constante ou une course de vitesse accélérée. Dans tous les cas, les animaux doivent être formés avant le premier test valide, car certains peuvent avoir besoin de plus de formation que les autres pour obtenir un niveau de base de la coordination motrice. Une limitation est représenté par les animaux différemment motivés pour effectuer cette tâche. Ceci, cependant, peut être compensée par des essais répétés d'au moins eree fois par jour de l'examen. Un autre test de comportement du moteur qui est très sensible dans la détection précoce des déficits moteurs est l'analyse 11 l'empreinte. Cependant, il est assez laborieuse parce que les animaux doivent être motivé pour courir sur une passerelle, après avoir plongé leurs pieds dans un réservoir de peinture. La qualité de l'empreinte peut varier dans une large mesure et un logiciel d'analyse assistée par est difficile. Par conséquent, nous préférons le test rotarod pour l'évaluation de la coordination motrice.
Le test du fil accroché évalué la force musculaire des membres. C'est un test assez grossier qui convient le mieux détecte les déficits musculaires au début quelques semaines après le début de la maladie 4. Cependant, il est très facile à réaliser et l'appareil d'essai entier peut être construit facilement. Un test plus élaboré pour la force musculaire est l'utilisation d'un transducteur 12 vigueur. Ici, la souris est invité à saisir une barre reliée à un capteur de force soit avec son arrière ou son avantpattes. Autres tests fonctionnels qui doivent être considérés incluent la mesure de la distance de roulement des roues ou même l'évaluation de l'activité en plein champ 3, 13. Cependant, dans notre expérience de la combinaison de la tige tournante et le test au fil pendre s'est avéré être le plus sensible, facilement réalisable et efficace du temps pour l'évaluation des souris G93A SOD1. Dans l'ensemble, une étude préclinique chez l'animal devrait être conçu avec beaucoup d'attention et devraient suivre les principes de base de quelques essais cliniques chez les humains comme décrit dans les lignes directrices CONSORT ( www.consort-statement.org ) 14. C'est alors seulement, l'utilisation d'animaux pour la recherche préclinique peut être justifié et les résultats peuvent finalement conduire à une traduction réussie dans une application en clinique humaine.
Ces résultats cliniques et comportementales doivent toujours être corrélée à une analyse de la pathologie de l'appareil neuromusculaire, y compris la moelle épinière motoneurone, axone et jonction neuromusculaire 14. Ici, une analyse de haute qualité de la moelle épinière pathologie du SNC est une condition sine qua non pour l'interprétation des effets de la survie ou la progression de la maladie. Parce que la fixation des tissus en profondeur est indispensable, la perfusion des animaux avec un paraformaldéhyde à 4% contenant du PBS-solution doit être normalisée ainsi. Afin d'être en mesure de retirer délicatement la moelle épinière une table de dissection doit être installé avec un microscope fixes d'exploitation et de beaux instruments chirurgicaux doivent être disponibles (voir la liste des instruments chirurgicaux ci-dessous). Après le cordon d'ensemble épinière a été supprimé, il peut être traité à la technique de découpage approprié (par exemple vibratome ou cryotome) et peut enfin être soumis à une analyse immunohistochimique. Ici, les paramètres d'évaluation de base sont les numéros des motoneurones de la moelle épinière et activés ou infiltrant des cellules gliales 10, 15. Selon la question de recherche initiale, additionnelle m immunohistochimiquearkers comme agrégats de SOD ou à l'intégrité endothélium CNS peut être évaluée. En outre, nerveux périphérique maladie du système pathologie peut être évaluée par un examen des axones des nerfs périphériques et des jonctions neuromusculaires. Seule la combinaison d'analyses cliniques et immunohistochimiques de SNC et du SNP fournir une vue complète de l'ensemble de la SLA pathologie qui doit être en corrélation avec les résultats cliniques.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
LT a reçu le soutien de la subvention de l'Forschungsförderungsprogramm l'université de Göttingen médecine. PL et MB ont été pris en charge par le Centre de recherche DFG de physiologie moléculaire du cerveau (CMPB), Göttingen. Les auteurs remercient le Dr Lars Tatenhorst de l'aide pour la vidéographie et Birgit Liebau de l'aide pour l'édition audio et vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
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