Summary
Een muismodel voor amyotrofische lateraal sclerose (ALS) is klinisch en gedragsmatig onderzocht. Als voorwaarde voor een begeleidende immunohistologische analyse de voorbereiding van het ruggenmerg wordt afgebeeld in detail.
Abstract
Amyotrofische lateraal sclerose (ALS) is een fatale neurodegeneratieve aandoening die leidt tot progressieve degeneratie van motoneuronen. Piek van aanvang is ongeveer 60 jaar voor de sporadische ziekte en rond de 50 jaar voor de familiale ziekte. Door zijn progressieve koers, 50% van de patiënten overlijdt binnen 30 maanden na de aanvang van de symptomen. Om nieuwe behandeling voor deze ziekte evalueren zijn genetische muismodellen van ALS is gegenereerd op basis van menselijke familiale mutaties in SOD gen, zoals SOD1 (G93A) mutatie. De belangrijkste aspecten die moeten worden geëvalueerd in het model zijn de totale overleving, klinisch beloop en motorische functies. Hier hebben we de klinische evaluatie aan te tonen, tonen de geleiding van twee gedrags-motortesten en zorgen voor kwantitatieve scoringssystemen voor alle parameters. Omdat een grondige analyse van de ALS-muismodel meestal vereist een immunohistochemische onderzoek van het ruggenmerg, tonen we aan de voorbereiding tot in detail de toepassing van het doenrsal laminectomie methode. Voorbeeldige histologische bevindingen worden aangetoond. De uitgebreide toepassing van de afgebeelde onderzoeksmethoden in studies naar het muismodel van ALS in staat zal stellen de onderzoeker om op betrouwbare wijze te testen toekomstige therapeutische opties die basis voor de latere klinische proeven op mensen kan bieden.
Protocol
Dieren werden gekocht bij Jackson Laboratory (# 002726) 1. Ze zijn klinisch gescoord en onderworpen aan een test van de motorische functie (rotarod test) en van de spierkracht (opknoping draad test). Al deze tests en de latere doden van de dieren om het ruggenmerg te bereiden zijn uitgevoerd in nauwe overeenstemming met de plaatselijke richtlijnen voor de juiste uitvoering van dierproeven.
1. Klinische score
Alleen moet worden beoordeeld bij een lichaamsgewicht van muizen worden onderzocht op tekenen van de motor tekort met de volgende 4 punt scoresysteem 2:
4 punten: normaal (geen teken van motorische disfunctie)
3 punten: achterpoot tremoren zijn duidelijk toen geschorst door de staart
2 punten: manier van lopen afwijkingen aanwezig zijn
1 punt: het slepen van ten minste een achterpoot
0 punten: symmetrischeverlamming onvermogen naar rechts zelf of verlies van 20% van de maximale lichaamsgewicht, in dit geval de dieren gedood en onmiddellijk het experiment wordt beëindigd
2. Tests van de motorische functie en spierkracht
Opknoping draad
Deze test wordt gebruikt om de spierkracht 3, 4 te beoordelen. Alle dieren deze test ten minste een of twee dagen na de rotarod test. Elke muis wordt geplaatst op een op maat gemaakte draad deksel met intervallen van 0,8 cm en voorzichtig op zijn kop zette, 60 cm boven een stro waarvoor bodem. Na de training gedurende drie opeenvolgende perioden van ten minste 180 is de latency te vallen wordt gemeten. Elke muis wordt tot drie pogingen vasthouden van de omgekeerde deksel maximaal 180 sec en het langst is opgenomen.
Rotarod Test
3, 4 te meten. Een goede prestatie vereist een hoge mate van sensomotorische coördinatie. De machine moet worden geplaatst in een rustige en niet-storende omgeving om afleidende stimuli voor de geteste dieren te voorkomen. Het bestaat uit een computer-gestuurde motor aangedreven roterende as en vijf banen van vijf muizen. Val van de muizen automatisch door druk op een kunststof plaat aan de onderzijde. Na opleiding drie keer ten minste 180 en met een constante snelheid van 15 rpm de tijd waarin een dier kunnen op de roterende staaf gemeten. Elk dier ondergaat drie proeven en het langst vertraging zonder te vallen wordt opgenomen. De tijd van 180 s wordt gekozen als cut-off tijd, omdat de meerderheid van de significante verschillen in motorische coördinatie worden gedetecteerd in deze periode.
3. Ruggenmerg Voorbereiding
- Dieren gedood worden door CO 2 inblazen in overeenstemming met de lokale richtlijnen en onmiddellijk transcardially geperfuseerd met PBS oplossing gevolgd door een 4% paraformaldehyde oplossing.
- Om de ruggengraat van de muis opgeofferd bereiden, wordt het dier gebracht op een operatietafel en de vier poten zijn bevestigd aan de zijde om de achterzijde van de muis bloot.
- Een korte wassen met een 70% ethanol-oplossing reinigt de site van dissectie en vlakt de vacht.
- Vervolgens wordt de huid wordt ingesneden met een scherp scalpel in de mediaanlijn. Ter vergemakkelijking van het snijden van de huid wordt uitgerekt op beide zijden. Als beenspieren wordt opgesteld, is hun huid ook te worden ingesneden.
- Nadat de huidincisie is voltooid, wordt het opzij getrokken met een pincet de onderliggende oppervlakkige fascia van het lichaam bloot.
- De spieren van de nek en de nekregio ligament moeten worden verwijderd en zijn carefully bereid. Zorg dat er geen incisie te diep en laesie van het ruggenmerg. De schouder spieren kan ook verwijderd worden om beter te kunnen ontmaskeren de wervelkolom.
- Vervolgens rugspieren worden uit de gehele wervelkolom.
- Voor het openen van de wervelkolom verschillende laminectomie worden uitgevoerd. Men moet uitgaan van de bovenste craniale deel op de plaats van het atlanto-occipitale gewricht.
- Het eenvoudigste is om de fixatie van de twee bovenste ledematen te verwijderen en de nek uitrekken om beter in staat om de laminectomie van de eerste wervels uit te voeren. Deze worden weggetrokken zonder het aanraken van de blootgestelde cervicale ruggenmerg.
- Meer wervels worden verwijderd door eerst de doorsnijden wervelbogen aan beide zijden schuin schaar en trekken aan de dorsale processen. Resterende zijdelen van de wervels worden verwijderd later volledige verwijdering van het ruggenmerg vergemakkelijken.
- Een anatomische oriëntatiepunt van de lumbale spinal koord is intumescence dat ook in het ruggenmerg.
- Het beëindigen van de laminectomie van het gehele ruggenmerg, zorg ervoor dat u ook alle ventrale wortels doorsnijden en laat het ruggenmerg van de dura mater van de hersenvliezen.
- Dan is de cervicale ruggenmerg wordt craniaal gesneden en u begint met het ruggenmerg te verwijderen.
- Tot slot het ruggenmerg is ook snijden in de distale cauda-equina om volledig vrijgegeven.
- Uiteindelijk wordt het ruggenmerg geplaatst in een postfixating oplossing (bijvoorbeeld 4% paraformaldehyde) nacht en verder verwerkt kan worden. We meestal cryosection het ruggenmerg voor te bereiden voor immunohistologische analyse.
4. Representatieve resultaten
De techniek van het ruggenmerg voorbereiding is de focus van deze video artikel. Het is een essentiële voorwaarde voor later weefsel snijden en uiteindelijk voor immunohistologische analyse van de spinal koord secties. Als voorbeeld van een eindresultaat, een immunohistochemische opwerking van het voorste deel van de hoorn muis lumbale ruggengraat van een wildtype (gew) en een SOD G93A transgen (tg) muis wordt aangetoond. Motor neuronen kunnen worden geïdentificeerd met een primaire anti-ChAT antilichaam en de daarop volgende fluorescerende labeling met een secundair Cy3 antilichaam. Bovendien is een nucleair contra-vlek met DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindool) uitgevoerd (figuur 1).
Figuur 1. TL microfoto het visualiseren van de immunodetectie van motoneuronen met anti-ChAT antilichaam (rood) en cellulaire kernen tegen de vlek door DAPI (blauw) in de muis lumbale ruggenmerg voorste hoorn van een wild-type (WT) (links) en van een SOD G93A transgene (tg) (rechts) muis op de leeftijd van 130 dagen. Schaal bar: 40 micrometer.
Als immunohistochemische analysede SOD G93A muizen is niet de primaire toepassingsgebied van dit artikel vindt u op de oorspronkelijke publicatie waarin deze transgene muizen zijn gekarakteriseerd en meer recente, die therapeutische benaderingen te bestuderen voor verdere referentie 1, 5, 6. Als therapeutische effecten wordt gedifferentieerd op het niveau immunohistologische duidelijk omschreven kwantitatieve evaluatie algoritmen moeten toegepast worden ondersteund door een Stereologische software (bijvoorbeeld zie 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De SOD1 (G93A) genetische muis-model is een waardevolle diermodel voor de ziekte loop van de progressieve motoneuron verlies te vergelijken met de menselijke amyotrofische laterale sclerose 8 te bestuderen. Een verscheidenheid aan verschillende behandeling paradigma's zijn geëvalueerd in dit model en vormen een basis voor de latere testen in menselijke klinische studies 8-10. Om te kunnen grote verschillen in een experimentele behandeling onderzoek bij deze muizen te detecteren, is van groot belang is ten minste 24 nest-gematchte genderevenwichtige muizen dezelfde genetische achtergrond zijn en een dubbelblind design 8 volgen. Vergelijkbaar met menselijke klinische studies, moet een uniform eindpunt criterium worden gekozen. Hier de meest gebruikte men het onvermogen van het dier zich naar rechts in 30 seconden na op zijn kant. Als dit criterium wordt bereikt het dier is geslacht en de levensduur van tijd, wordt als de tijd van overleven.
Treatment studies kunnen worden gestart op een presymptomatische klinische toestand (bijvoorbeeld op dag van het leven (DOL) 50 of zelfs op DOL 30) wanneer de dieren nog niet vertonen tekenen van motorische disfunctie en zou worden gescoord met 4 punten in onze klinische scoringssysteem . Een andere mogelijkheid bestaat uit een symptomatische behandeling aanpak die moet beginnen bij de eerste klinische symptomen verschijnen en achterpoot tremoren zijn duidelijk als het dier wordt geschorst door de staart. Dit wordt gedefinieerd als begin van de ziekte en deze eerste ziektestadium wordt beoordeeld met de klinische score 3. Belangrijke beperkingen in het testen van de motorische functie en spierkracht meestal alleen meer dan twee tot vier weken later. Net als op het gemiddelde van de dieren bij de eerste klinische stadium van de ziekte rond DOL 80, sommige onderzoekers beginnen hun symptomatische behandeling van alle dieren op dit moment punt in een vereenvoudigde benadering. In beide instellingen is het verplicht om toezicht te houden progressie van de ziekte. Dit moet worden gestart op het moment van aanvang van de behandeling voor presympmatisch behandelde dieren (DOL 50 of DOL 30, respectievelijk) of bij DOL 70 voor symptomatisch behandeld dieren. Bewaking van de progressie van de ziekte bestaat uit een twee keer per week de bepaling van het lichaamsgewicht, klinische neurologische scoren en testen van de motorische functie en spierkracht. Als de dieren komen klinische score 1 (slepen van ten minste een achterpoot) raden we aan de dagelijkse bepaling van het lichaamsgewicht en klinische controle uit te voeren om te voorkomen dat de klinische score 0 punten (symmetrisch verlamming, niet in staat te missen naar rechts zelf of verlies van 20 % van de maximale lichaamsgewicht) wanneer de dieren moeten onmiddellijk worden gedood en het experiment wordt beëindigd. Het wordt aanbevolen om een first-time onderzoeker wordt begeleid door een ervaren dier onderzoeker die helpt om ook detecteren subtiele klinische tekenen van progressie. De klinische 4 punten te scoren systeem na Weydt et al. 2 is goed ingeburgerd in het veld en is een betrouwbaar systeem met behulp van criteria die duidelijk van elkaar te onderscheiden. Eenmeer subtiele differentiatie van de klinische symptomen zou minder duidelijk en sterk onderzoeker afhankelijk.
Om sporen gedragsstoornissen verschillende proef paradigma is. De meeste auteurs voorstander van de rotarod test die het vermogen van het dier om te draaien op een roterende cilinder 4, 11 evalueert. In een studie ter evaluatie van de betekenis van gedragstesten in het SOD1 G93A muismodel de rotarod-test bleek zeer gevoelig in het opsporen van significante verschillen tussen wildtype en transgene muizen zo vroeg vanaf week 16 van leeftijd op 11. Mogelijke aanpassingen zijn onder andere draait op een constante snelheid of een versnelde snelheid run. In ieder geval, de dieren moeten worden opgeleid voordat de eerste geldige testen omdat sommige kunnen meer training dan anderen nodig hebt om een basisniveau van motorische coördinatie te verkrijgen. Een beperking wordt vertegenwoordigd door een andere manier gemotiveerd dieren om deze taak uit te voeren. Dit kan echter worden gecompenseerd door herhaalde proeven ten minste three keer per examendag. Een andere motor gedragstest die zeer gevoelig is bij het opsporen van vroege motorische stoornissen is de footprint analyse 11. Echter, het is heel bewerkelijk, omdat de dieren moeten worden gemotiveerd om te lopen over een loopplank na hun voeten ondergedompeld in een reservoir van verf. De kwaliteit van de voetafdruk kan variëren voor een groot deel en een software-gesteunde analyse bemoeilijkt. Daarom hebben we de voorkeur aan de rotarod test voor de evaluatie van de motorische coördinatie.
De opknoping draad-test geëvalueerd spierkracht van de ledematen. Het is een vrij ruwe test die begin van de gespierde tekorten beste detecteert een paar weken na het begin van de ziekte 4. Het is echter zeer eenvoudig uit te voeren om de gehele proefapparatuur gemakkelijk worden geconstrueerd. Een nadere controle voor spierkracht is het gebruik van een krachtopnemer 12. Hier wordt de muis gevraagd bar verbonden met een krachtopnemer grijpen met ofwel de achterpoten of de voorgrondpoten. Andere functionele tests die moeten worden beschouwd aan het meten van het loopwiel afstand of de evaluatie van het open veld activiteit 3, 13. Echter, in onze ervaring de combinatie van de rotarod en de opknoping draad-test bleek het meest gevoelig, eenvoudig uitvoerbaar is en de tijd efficiënt voor de evaluatie van de SOD1 G93A muizen. In het algemeen dient een preklinische studie bij dieren zeer zorgvuldig worden ontworpen en moeten de basisprincipes van een klinische testen als beschreven in de CONSORT richtlijnen ( www.consort-statement.org ) 14. Alleen dan kan het gebruik van dieren voor preklinisch onderzoek te rechtvaardigen en de resultaten kunnen uiteindelijk leiden tot een succesvolle vertaling in een menselijke klinische toepassing.
Deze klinische en gedragsmatige bevindingen moet altijd worden gecorreleerd met een analyse van de pathologie van de neuromusculaire apparaat met inbegrip van het ruggenmerg motoneuron, axon en neuromusculaire knooppunt 14. Hier, een hoogwaardige analyse van CNS ruggenmerg pathologie is een voorwaarde voor de interpretatie van effecten in overleving of progressie van de ziekte. Omdat grondig weefsel fixatie kritisch dienen de perfusie van de dieren met een 4% paraformaldehyde met PBS-oplossing en gestandaardiseerd. Om te kunnen verwijder het ruggenmerg een snijtafel worden geïnstalleerd met een vaste operatiemicroscoop en fijne chirurgische instrumenten beschikbaar te zijn (zie de lijst van chirurgische instrumenten hieronder). Nadat de gehele ruggenmerg is verwijderd, kan worden verwerkt om de juiste snijden techniek (bijvoorbeeld vibratome of cryotome) en kan uiteindelijk onderworpen aan Immunohistologische analyse. Hier fundamentele evaluatie parameters zijn de nummers van het ruggenmerg en de motoneuronen geactiveerd of infiltrerende gliacellen 10, 15. Afhankelijk van de oorspronkelijke onderzoeksvraag, extra immunohistochemische markers zoals SOD aggregaten of CNS endotheel integriteit kan worden geëvalueerd. Bovendien kan perifere zenuwstelsel ziekte pathologie worden geëvalueerd door onderzoek van perifere zenuwen axonen en van neuromusculaire juncties. Alleen de combinatie van zowel klinische als immunohistochemische analyses van CNS en PNS voorziet in een grondige oog op de door ALS pathologie die moet worden gecorreleerd met de klinische bevindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
LT heeft ontvangen subsidies van de Forschungsförderungsprogramm van de Universiteit Geneeskunde Göttingen. PL en MB werden gesteund door de DFG Research Centrum voor Moleculaire Fysiologie van de hersenen (CMPB), Göttingen. De auteurs danken dr. Lars Tatenhorst voor hulp bij het videografie en Birgit Liebau voor hulp bij het audio-en videobewerking.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).
