Summary
Um modelo do rato para a esclerose lateral amiotrófica (ELA) é examinado clinicamente e comportamentalmente. Como um pré-requisito para uma análise imuno acompanha a preparação da medula espinal é descrito em detalhe.
Abstract
Esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma desordem neurodegenerativa fatal resultando em degeneração progressiva dos motoneurónios. Pico de início é em torno de 60 anos para a doença esporádica e em torno de 50 anos para a doença familiar. Devido ao seu curso progressivo, 50% dos pacientes morrem dentro de 30 meses de início dos sintomas. A fim de avaliar as opções de novo tratamento para esta doença, os modelos murinos genéticos de ALS foram gerados com base em humanos mutações da família no gene SOD, tais como a mutação SOD1 (G93A). Aspectos mais importantes que têm de ser avaliados no modelo são em geral curso de sobrevivência, clínica e da função motora. Aqui, demonstramos a avaliação clínica, mostram a realização de dois testes motores comportamentais e fornecer sistemas de pontuação para todos os parâmetros quantitativos. Porque uma análise em profundidade do modelo de mouse ALS normalmente exige um exame imunohistoquímico da medula espinhal, que demonstram a sua preparação em detalhe a aplicação do fazermétodo laminectomia Rsal. Exemplares achados histológicos são demonstrados. A aplicação integral dos métodos de exame descritas em estudos sobre o modelo do rato de ALS permitirá ao pesquisador confiável testar futuras opções terapêuticas que podem fornecer uma base para mais tarde ensaios clínicos humanos.
Protocol
Os animais foram adquiridos a Jackson Laboratory (# 002,726) 1. Eles são clinicamente marcados e submetidos a um teste de função motora (rotarod teste) e da força muscular (pendurado teste do fio). Todos estes ensaios ea morte dos animais mais tarde, a fim de preparar a medula espinal foram realizados em conformidade muito perto das orientações locais para a conduta apropriada de experiências com animais.
1. Pontuação clínica
Para além da avaliação para os ratos de peso corporal são examinados para sinais de déficit motor com o seguinte sistema de pontuação de 4 pontos 2:
4 pontos: normal (sem sinal de disfunção motora)
3 pontos: tremores nos membros posteriores são evidentes quando suspenso pela cauda
2 pontos: anormalidades da marcha estão presentes
1 ponto: arrastando de pelo menos um membro posterior
0 ponto: simétricoincapacidade paralisia, para a direita em si ou a perda de 20% do peso corporal máximo; neste caso, os animais são sacrificados imediatamente ea experiência é terminada
2. Testes da função motora e força muscular
Pendurado fio
Este teste é utilizado para avaliar a força muscular 3, 4. Todos os animais realizar este teste, pelo menos, um ou dois dias após o teste de rotarod. Cada rato é colocado em uma tampa de arame sob medida com intervalos de 0,8 cm e cautelosamente virou de cabeça para baixo, 60 cm acima de um fundo de palha coberto. Após a formação por três vezes consecutivas de pelo menos 180 s a latência para cair é medido. Cada rato é dada até três tentativas para segurar a tampa invertida para um máximo de 180 S e no período mais longo é gravado.
Rotarod Teste
3, 4. Um bom desempenho requer um elevado grau de coordenação sensório. A máquina deve ser colocado em um ambiente calmo e não-perturbador para evitar estímulos de interferências para o animal testado. É constituída por uma controlado por computador do fuso motorizado rotativo e cinco pistas durante cinco ratinhos. Quedas dos ratinhos são detectados automaticamente pela pressão sobre uma placa de plástico na parte inferior. Após a formação por três vezes consecutivas de pelo menos 180 S a uma velocidade constante de 15 rpm, o tempo para o qual um animal pode permanecer sobre a haste rotativa é medido. Cada animal passa por três provas e mais longa latência, sem cair é gravado. O tempo de 180 s é escolhido como cut-off tempo, porque a maioria das diferenças significativas na coordenação motora são detectados neste espaço de tempo.
3. Preparação da Medula Espinhal
- Os animais são mortos por insuflação de CO 2, de acordo com as orientações locais e são imediatamente perfundido transcardially com solução de PBS, seguido por uma solução de paraformaldeído a 4%.
- A fim de preparar a medula espinal do rato sacrificados, o animal é colocado sobre uma mesa de operação e os quatro membros são fixados no lado, a fim de expor o lado de trás do rato.
- Um curto da lavagem com uma solução de etanol a 70% limpa o local de dissecção e achata a pêlo.
- Em seguida, a pele é incisão com um bisturi afiado na linha mediana. A fim de facilitar o corte da pele é esticada para ambos os lados. Se os músculos das pernas devem ser preparadas, sua pele também tem de ser feita uma incisão.
- Após a incisão na pele é completado, é puxado para o lado com um par de pinças para expor a fáscia superficial do corpo.
- A musculatura do pescoço e do ligamento nucal tem que ser removido e são carefully preparado. Tenha cuidado para não incisar a profundamente e lesão na medula espinhal. Os músculos do ombro também pode ser removido de modo a melhor expor a coluna vertebral.
- Em seguida, os músculos paravertebrais são removidos a partir de toda a coluna vertebral.
- A fim de abrir os laminectomias da coluna vertebral vários têm de ser realizados. Deve-se começar a partir da parte superior do crânio no local da articulação atlanto-occipital.
- É mais fácil remover a fixação dos dois membros superiores e esticar o pescoço para ser mais capazes de realizar a laminectomia das vértebras primeiro. Estes são afastou sem tocar o exposto medula espinhal cervical.
- Mais vértebras são removidos por primeiro rasguem a arcos vertebrais em ambos os lados com uma tesoura em ângulo e, em seguida, puxando os processos dorsal. Restantes partes laterais das vértebras devem ser removidos para facilitar a posterior remoção completa da medula espinhal.
- Um marco anatômico da espinha lombarl é o cabo de intumescência que também está presente na medula cervical.
- Tendo terminado a laminectomia de toda a medula espinhal, certifique-se que você também transect todas as raízes ventrais e liberar a medula espinhal a partir da dura-máter das meninges.
- Em seguida, a medula espinhal cervical cranial é cortado e você começa a remover a medula espinhal.
- Finalmente, a medula espinhal é também cortado na cauda distal-eqüina para ser completamente liberado.
- Em última análise, a medula espinal é colocado dentro de uma solução postfixating (por exemplo, paraformaldeído a 4%) durante a noite e podem ser posteriormente tratados. Nós geralmente cryosection da medula espinhal para prepará-lo para análise imuno.
4. Os resultados representativos
A técnica de preparação da medula espinal representa o foco deste artigo de vídeo. É um pré-requisito essencial para o seccionamento de tecidos mais tarde e, finalmente, para análise imuno de espinhaCabo seções l. Como um exemplo de um resultado final, um workup imuno-histoquímica da região corno anterior do rato medula espinal lombar de um tipo selvagem (wt) e de um SOD G93A transgene (TG) do rato é demonstrada. Neurónios motores pode ser identificado com um anticorpo anti-ChAT primária e subsequente marcação fluorescente com um anticorpo secundário Cy3. Além disso, um nuclear contra-mancha com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) foi realizada (Figura 1).
Figura 1. Fotomicrografias fluorescentes visualizando a imunodetecção de motoneurónios com anticorpo anti-ChAT (vermelho) e núcleos celulares contra-mancha por DAPI (azul) no corno cabo de rato vertebral lombar anterior de um tipo selvagem (wt) (à esquerda) e do um SOD G93A transgênicos (TG) (à direita) do mouse com a idade de 130 dias. Barra de escala: 40 mM.
Como a análise imuno-histoquímica deos ratinhos de SOD G93A não é o âmbito primário deste artigo consultar a publicação original em que estes ratinhos transgénicos foram caracterizados e os mais recentes que estudam abordagens terapêuticas para referência futura 1, 5, 6. Se os efeitos terapêuticos deve ser diferenciado do nível imuno claramente definida algoritmos de avaliação quantitativa deve ser aplicada suportado por um software estereológica (por exemplo ver 7).
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Discussion
A SOD1 (G93A) modelo do rato genético é um valioso modelo animal para estudar o curso da doença de perda progressiva dos motoneurônios comparável à esclerose amiotrófica lateral, humano 8. Uma variedade de paradigmas de tratamento diferentes foram avaliados neste modelo e representam uma base para posterior teste em humanos 8-10 estudos clínicos. A fim de ser capaz de detectar diferenças significativas em um estudo de tratamento experimental nestes ratinhos, é de importância primordial para incluir pelo menos 24 género equilibradas-lixo combinados ratinhos do mesmo fundo genético e seguem um desenho duplo-cego 8. Comparável com estudos clínicos humanos, um critério de ponto de extremidade único e uniforme devem ser escolhidos. Aqui, a um mais utilizado é a incapacidade do animal para a direita-se em 30 segundos após ter sido colocado no seu lado. Se este critério é atingido o animal é sacrificado eo seu tempo de vida é registado como o tempo de sobrevivência.
Treatmeestudos NT pode ser iniciado em um estado pré-sintomático clínico (por exemplo, no dia de vida (DOL) 50 ou até mesmo em DOL 30) quando os animais ainda não apresentam qualquer sinal de disfunção motora e seria marcado com 4 pontos em nosso sistema de pontuação clínica . Outra possibilidade consiste em uma abordagem de tratamento sintomático, que deve começar quando o primeiro sintoma clínico aparece e tremores dos membros posteriores são evidentes quando o animal é suspenso pela cauda. Este é definido como o início da doença e nesta fase inicial da doença é classificada com o escore clínico 3. Deficiências significativas nos testes de função motora e da força muscular em sua maioria ocorrem apenas mais do que 2-4 semanas mais tarde. Como, em média, os animais atingirem o estágio da doença clínica inicial em torno de DOL 80, alguns pesquisadores começam o tratamento sintomático de todos os animais, neste ponto do tempo em uma abordagem simplificada. Em ambas as configurações é obrigatório para monitorar a progressão da doença. Isto deve ser iniciada no momento da iniciação do tratamento para presympmaticamente animais tratados (DOL 50 ou DOL 30, respectivamente) ou em DOL 70 para os animais tratados sintomaticamente. Monitoramento da progressão da doença inclui uma determinação duas vezes por semana do peso corporal, escore clínico neurológico e testes de função motora e força muscular. Se os animais atingirem escore clínico 1 (arrastando de pelo menos um dos membros posteriores) recomendamos para executar a determinação diária do peso corporal e acompanhamento clínico a fim de não perder a clínica escore 0 ponto (paralisia simétrica, incapacidade de direito próprio ou prejuízo de 20 % do peso corporal máximo) quando os animais devem ser sacrificados imediatamente e que a experiência é encerrado. Recomenda-se que um examinador pela primeira vez é orientado por um pesquisador experiente animais que ajuda a detectar também sutis sinais clínicos de progressão. A clínica 4 sistema de pontuação ponto-após Weydt et al 2 está bem estabelecida no campo e é um sistema confiável usando critérios que podem ser claramente diferenciados. Adiferenciação mais sutil de sintomas clínicos seria menos clara e altamente examinador dependente.
A fim de detectar déficits comportamentais uma variedade de paradigmas de teste está disponível. A maioria dos autores favorecer o teste rotarod que avalia a capacidade do animal para rodar em um cilindro rotativo 4, 11. Em um estudo de avaliação da significância de testes comportamentais no modelo do rato SOD1 G93A o teste rotarod provou ser muito sensíveis para detectar diferenças significativas entre o tipo selvagem e ratinhos transgénicos tão cedo quanto a partir de 16 semanas de idade, em 11. Eventuais modificações incluem rodando a uma velocidade constante ou uma corrida de velocidade acelerada. Em qualquer caso, os animais têm que ser treinados antes do primeiro teste válido, porque alguns podem precisar de mais treinamento do que os outros a obter um nível básico de coordenação motora. Uma limitação é representada por animais diferentemente motivados para executar esta tarefa. Isto, no entanto, pode ser compensado por meio de testes repetidos de, pelo menos, three vezes por dia do exame. Outro teste comportamental do motor que é muito sensível na detecção de déficits motores iniciais é a análise da pegada 11. No entanto, é bastante trabalhosa, porque os animais têm de ser motivadas para correr sobre um corredor, depois de ter os seus pés mergulhada em um reservatório de tinta. A qualidade da pegada pode variar em grande medida e um software de análise auxiliada por é difícil. Portanto, preferimos o teste rotarod para a avaliação de coordenação motora.
O teste de fio pendurado avaliada a força muscular dos membros. É um teste bastante rudimentar que melhor identifica déficits musculares no início algumas semanas após o início da doença 4. No entanto, é muito fácil de executar e do aparelho de teste completo pode ser facilmente construída. Um teste mais elaborado para a força muscular é a utilização de um transdutor de força 12. Aqui, o rato é solicitado para agarrar uma barra ligada a um transdutor de força quer com a sua traseira ou dianteira suapatas. Outros testes funcionais que têm de ser considerados incluem a medição da distância roda de corrida ou mesmo a avaliação da actividade de campo aberto 3, 13. No entanto, na nossa experiência a combinação da rotarod eo teste de fio pendurado provou ser mais sensível, facilmente praticável e tempo eficaz para a avaliação dos ratinhos SOD1 G93A. Em geral, um estudo pré-clínico em animais devem ser projetados com muito cuidado e deve seguir os princípios básicos de uma ensaios clínicos humanos, tal como descrito nas orientações CONSORT ( www.consort-statement.org ) 14. Só então, a utilização de animais para a pesquisa pré-clínico pode ser justificada e os resultados podem em última análise, levar a uma tradução bem sucedida em uma aplicação clínica humana.
Estes resultados clínicos e comportamentais devem sempre ser correlacionada com uma análise da patologia da unidade neuromuscular incluindo medula espinal motoneurônio, axônio e junção neuromuscular 14. Aqui, uma análise de alta qualidade do CNS medula espinhal patologia é um pré-requisito para a interpretação dos efeitos na sobrevivência ou a progressão da doença. Porque a fixação do tecido minuciosa é crítica, a perfusão dos animais com uma paraformaldeído a 4% contendo PBS-solução deve ser padronizado bem. A fim de ser capaz de remover cuidadosamente a medula espinal uma mesa de dissecação deve ser instalado juntamente com um microscópio de operação fixa e finas instrumentos cirúrgicos têm que estar disponíveis (ver a lista de instrumentos cirúrgicos, abaixo). Depois de toda a medula espinal foi removido, pode ser processado para a técnica de corte apropriada (por exemplo, vibratome ou cryotome) e, finalmente, pode ser submetido a análise imuno. Aqui, os parâmetros de avaliação básicos são o número de motoneurônios na medula espinhal e ativadas ou infiltrando células gliais 10, 15. Dependendo da questão de pesquisa original, m imunohistoquímica adicionalarkers como agregados de SOD ou a integridade do CNS endotélio pode ser avaliada. Além disso, nervoso periférico sistema patologia da doença pode ser avaliada por análise de axónios dos nervos periféricos e das junções neuromusculares. Somente a combinação de análises clínicas e imunohistoquímica do SNC e SNP fornecer uma visão geral completa do ALS patologia que tem de ser correlacionado com os achados clínicos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
LT recebeu apoio concessão do Forschungsförderungsprogramm da Medicina da Universidade de Göttingen. PL e MB foram apoiados pelo Centro de Pesquisas DFG para Fisiologia Molecular do Cérebro (CMPB), Göttingen. Os autores agradecem ao Dr. Lars Tatenhorst de assistência com videografia e Liebau Birgit ajuda com áudio e edição de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
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