Summary
Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.
Abstract
Mouse fibroblasti embrionali (MEF) sono stati usati per creare cellule staminali embrionali umane (hESC) colture dopo l'isolamento blastocisti 1. Questo sistema di alimentazione mantiene hESCs dal subire differenziazione spontanea durante l'espansione delle cellule. Tuttavia, questo metodo di co-cultura è un lavoro dispendioso, richiede personale altamente qualificato, e la purezza hESC rendimenti bassi 4. Molti laboratori hanno tentato di minimizzare il numero di cellule feeder in colture hESC (cioè incorporando matrice rivestite piatti o altri tipi di cellule alimentatore 5-8). Questi sistemi di coltura modificati hanno mostrato qualche promessa, ma non hanno soppiantato il metodo standard per hESC coltura con fibroblasti di topo mitomicina C trattati con embyronic al fine di ritardare indesiderato differenziazione spontanea delle culture hESC. Pertanto, le cellule di alimentazione utilizzati in espansione hESC devono essere rimosse durante esperimenti di differenziazione. Sebbene diverse tecniche sono disponibili per purificare il co hESClonies (FACS, MACS, o l'uso di vettori resistenti ai farmaci) da alimentatori, queste tecniche sono alta intensità di manodopera, costoso e / o distruttiva per la cellule staminali embrionali umane. Lo scopo di questo progetto è stato quello di inventare un metodo di purificazione che consente la raccolta di una popolazione pura di hESC. Abbiamo osservato che in una cultura hESC confluenti, la popolazione MEF può essere rimosso con una semplice e rapida aspirazione del foglio MEF. Questa rimozione dipende da diversi fattori, tra laterale cellula-cellula legame di MEFs che hanno una bassa affinità di legame alla piastra di coltura stirene, e la capacità di colonie di cellule staminali per spingere i fibroblasti verso l'esterno durante la generazione della propria " di nicchia ". Il hESC sono stati poi esaminati per SSE-4, Oct3 / 4 e Tra 1-81 espressione fino a 10 giorni dopo la rimozione MEF per garantire il mantenimento della pluripotenza. Inoltre, le colonie hESC sono stati in grado di continuare a crescere in grandi formazioni da dopo la rimozione del MEF, che fornisce un ulteriore livello di espansione cellule staminali embrionali umane.
Protocol
1. Preparazione di Alimentatori embrionali di topo
- Il MEFs utilizzato nella co-coltura delle hESC devono essere preventivamente trattati mediante irradiazione o mitomicina-C per inibire le cellule dalla fase di divisione.
- Due ore prima della semina MEF, cappotto ogni plasma 60 mm trattato piastra di coltura con 2 ml di 0,05% gelatina.
- Scongelare una fiala di trattato MEF e piastra a ~ 20.000 cellule / cm 2.
- Consentire alle cellule di aderire durante la notte.
2. Co-semina hESC sul MEF
- Nuove colonie possono essere avviate da colture crioconservati o passaging culture attuali sui nuovi MEF rivestite piatti, come indicato di seguito.
- Lavare la piastra contenente le colonie hESC grandi da diversi passaggi 1 volta con 3 ml di caldo 1x PBS.
- Aggiungere 3 ml di collagenasi IV / PBS soluzione (1 mg / ml), e incubare per 5-10 minuti a 37 ° C. (Nota: Le cellule non diventerà distinto o palla come visto con tripsina).
- Mentre le cellule sono ancora nellacollagenasi, utilizzare un bordo di una punta di pipetta da 5 ml, creare un modello di griglia sulle colonie, il loro inserimento in ciuffi piccole cellule.
- Utilizzare l'estremità della punta di pipetta (tenuto in maniera perpendicolare alla piastra di coltura) a raschiare il fondo della piastra di coltura, rimuovendo tutte le cellule dalla superficie.
- Raccogliere le cellule in un tubo Falcon e centrifugare a (1000 rpm) per 5 min.
- Dopo centrifugazione, aspirare il terreno, lasciando il pellet di cellule nel tubo Falcon.
- Aspirare il mezzo MEF dal placcato MEF il giorno prima.
- Re-piastra le cellule in un rapporto 1:3 dalla piastra originale, e mangimi con 3 ml di terreno hESC
3. L'esaurimento MEF dal Co-cultura
Nota: le culture umane CES deve essere ad alta densità, di solito tra 10 e 14 giorni di coltura.
- Posizionare la punta di una pipetta aspirante sul bordo della piastra e consentire l'aspirazione di tirare delicatamente il bordo del foglio MEF.
- RTogliete il supporto dal piatto, e che questo venga a prendere il foglio di cella e spostare lentamente la punta in modo arcuato sopra la piastra. Nota: Il foglio può intasare la punta della pipetta, ma questo non è un problema in quanto non deve impedire all'utente di tirare manualmente il foglio dalla superficie della piastra di coltura. Se le cellule sono bloccati alla fine dell'aspiratore, è possibile utilizzare la parte superiore del piatto di coltura per rompere il foglio cella per la completa aspirazione.
- Sostituire media hESC immediatamente, e mettere la piastra posteriore nell'incubatore.
4. Risultati rappresentativi
Il risultato finale del processo di rimozione MEF produce piccole colonie hESC inalterate (Figura 1D) in grado di sottoporsi a una forte espansione in colonie molto grandi (Figura 2), pur mantenendo l'espressione dei produttori di pluripotenza SSE-4 ottobre, ¾, e TRA 1-81 (Figura 3).
Figura 1. ESC Colony Morfologia Prima e dopo la rimozione del MEF. Umani embrionali colonie di cellule staminali in A) giorno 1 e B) 2 ° giorno dopo la semina su piastre di coltura. C) ad alta densità Colonie umane embrionali cellule staminali (H7) circondato da MEF. Le due colonie hESC sono descritti nella trattini rossi. D) Dopo la rimozione MEF utilizzando la tecnica di aspirazione descritta, ci ritroviamo con una colonia di cellule staminali embrionali umane isolato con pochissimi MEF che circonda la colonia intatto.
Figura 2. Colony espansione ESC 10 giorni dopo la rimozione MEF. La colonia hESC originale immediatamente dopo l'esaurimento MEF (a sinistra) è consentito di espandersi in una colonia molto grande (a destra) approximately 800 micron, 10x. Si noti che la colonia originale immaginata allo stesso ingrandimento (10x) come colonia composito.
Figura 3. Immunostaining del MEF-impoverito colonie hESC. Identificazione immunofluorescente delle colonie fino a 10 giorni dopo l'esaurimento MEF indica che le colonie mantenere la loro espressione di marcatori di pluripotenza, come evidente da ottobre ¾, SSE-4, e Tra-1-81 colorazione. Inoltre, queste colonie hESC non presentano differenziazione verso un destino mesodermica, indicato dall'assenza di Flk-1. A, E, I e M) sono immagini di trasmissione della luce delle colonie immunoflouscently macchiati, 20, 10, 10 e 2x, . rispettivamente B, F, J e N) mostrano i nuclei -. cellule DAPI colorate delle colonie immunofluorescently macchiati, 20, 10, 10 e 2x, rispettivamente CD) mostrano l'espressione dimarcatore di cellule staminali umane SSE-4 solo, e l'immagine composita, 20x. GH) mostrano l'espressione di cellule staminali umane marcatore ottobre ¾ solo, e l'immagine composita, KL 10x.) mostrano l'espressione del marcatore di cellule staminali umane Tra 1-81 solo , e l'immagine composita, 10x. MP) L'ultima riga se le immagini ritraggono una colonia raffigurante i confini tipici lisce visto in questo ingrandimento, 2x, e queste colonie non ha espresso O) Flk-1, un marker precoce di differenziazione mesoderma, né essi P) contiene fibroblasti come dimostra l'assenza di colorazione DDR2.
Video supplementare. Rimozione fibroblasti da aspirazione Foglio. Clicca qui per visualizzare filmati .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo presentato in questo manoscritto offre un'alternativa rapida e meno costosa per eliminare cellule di alimentazione fibroblasti umani da colture di cellule embrionali. Un'efficace rimozione dei fibroblasti dipende dall'esistenza di un monostrato confluente strettamente di queste cellule che si sviluppa in colture di cellule staminali più lunghi. Dopo 7-10 giorni, le colonie hESC crescenti spingerà i fibroblasti feeder in una direzione verso l'esterno, generando un monostrato di fibroblasti sempre più fitta tra colonie. Le forti cellula-cellula allegati all'interno del monostrato di fibroblasti consentire la rapida eliminazione come strato cellulare. Va notato attentamente che questa tecnica di purificazione è suggerito per uso come metodo di rimozione MEF da hESC prima sperimentazione solo, e non utilizzata per la cultura espansione routine.
È anche possibile utilizzare questa tecnica di purificazione per salvare scarsa qualità colonie di cellule staminali. Un alto colonia di cellule staminali embrionali umane di qualità deve presentare distiNCT confini tra di loro e le cellule di alimentazione. Se, tuttavia, le colonie di cellule staminali hanno subito differenziazione parziale, esibendo meno ben definiti colonia, questo metodo può anche essere usato per rimuovere le colonie hESC parzialmente differenziate con strato di cellule MEF, tuttavia, la separazione fisica dei colonie hESC con una punta di pipetta può essere necessario separare le connessioni hESC con le cellule indesiderate differenziate o MEF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da un premio II Facoltà di nuovo dal California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), e un NIH-finanziato Premio Nazionale delle Ricerche (F32-HL104924)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.
