Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma
Summary
Geçiş kültürlere besleyici-özgür koşullarda devam eden çabalarına rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve türetme ve kültürü fare embriyonik besleyiciler (MEFS) ile işbirliği kültürler büyük oranda bağımlı kalır. Burada, biz hızla öncesi deneylere hESC kültürlerden besleyiciler kaldırmak için yeni bir metodoloji göstermektedir.
Abstract
Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) blastosist izolasyonu 1 sonra insan embriyonik kök hücreleri (hESC) kültürler kurmak için kullanıldı. Bu besleyici sistem hücre genişleme sırasında spontan farklılaşma geçiren gelen hESC korur. Ancak, bu ko-kültür yöntemi, emek yoğun bir yüksek eğitimli personel gerektirir ve verimleri düşük hESC saflık 4. Birçok laboratuar hESC kültürlerinde besleyici hücrelerin sayısının (yani matriks kaplı yemekleri veya diğer besleyici hücre tipleri 5-8 birleşmeyle) en aza indirmek için çalışmışlardır. Bu modifiye edilmiş kültür sistemlerinin bazı söz göstermiştir, ancak mitomisin C ile tedavi edilen fare embyronic fibroblast ile kültür hESC hESC kültürlerin istenmeyen spontan farklılaşma geciktirmek amacıyla için standart yöntem üstlenilmekle değil. Bu nedenle, hESC genişleme kullanılan besleyici hücrelerin farklılaşması deneyler sırasında kaldırılması gerekir. Çeşitli teknikler HESC eş saflaştırılması için kullanılabilir olmasına rağmenserme lonies (FACS, MACS veya ilaca dirençli vektörlerin kullanımı), bu teknikler emek, yoğun masraflı ve / veya hESC için zararlıdır. Bu proje hedefi hESC daha saf bir nüfusun Hasat sağlayan saflaştırılması için bir yöntem bulmak olmuştur. Biz birleşik hESC kültür, MEF nüfus MEF levha basit ve hızlı bir aspirasyon kullanılarak temizlenebilir olduğunu gözlemledim. Bu kaldırma "yanal hücre-hücre stiren kültür çanak için daha düşük bir afiniteye sahip MEFS bağlayıcı ve kendi üretimi sırasında dışa fibroblastlar itmek için kök hücre kolonilerinin yeteneği dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır niş ". HESC sonra pluripotency devamını sağlamak için MEF uzaklaştırıldıktan sonra 10 gün için SSEA-4, Oct3 / 4 ve Tra 1-81 ifade için incelendi. Ayrıca, hESC koloniler hESC genişleme ek bir düzeyde sağlayan, MEF çıkarıldıktan sonra daha büyük oluşumların içine büyüyen devam başardık.
Protocol
Discussion
Bu yazıda sunulan yöntem, insan embriyonik hücre kültürlerinden fibroblast besleyici hücreler ortadan kaldırmak için hızlı ve az masraflı bir alternatif sunuyor. Fibroblastların başarılı kaldırılması artık kök hücre kültürlerinde gelişen bu hücrelerin sıkıca konfluent Monolayer varlığına bağlıdır. 7-10 gün sonra büyüyen hESC koloniler koloniler arasında giderek yoğun fibroblast monolayer üreten, dışa doğru besleyici fibroblastlar itecektir. Fibroblast monolayer içindeki güçl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Rejeneratif Tıp California Institute (RN2-00921-1) ve bir NIH tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Ödülü (F32-HL104924) bir Yeni Fakülte Ödülü II tarafından finanse edildi
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. . Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .
