Несмотря на предпринимаемые усилия по переходу культур подачи без условий, получение и культуру человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) по-прежнему во многом зависит от совместных культурах с мышиных эмбриональных фидеров (МЭФ). Здесь мы покажем новую методологию для быстрого удаления фидеров от чЭСК культур до экспериментов.
Abstract
Мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ), были использованы для создания человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) культур после бластоцисты изоляции 1. Эта система поддерживает подачи ЭСК от прохождения спонтанной дифференцировки в процессе клеточного роста. Тем не менее, это сотрудничество культуру метод трудоемкий, требует высококвалифицированного персонала, и дает низкую чистоту чЭСК 4. Во многих лабораториях пытались свести к минимуму количество фидерных клеток в культуре ЭСК (т.е. включающие матрицы покрытием блюда или другие устройства подачи типы клеток 5-8). Эти изменения системы культуры показали некоторые надежды, но не вытеснил стандартный метод культивирования ЭСК митомицином С обработанной фибробластов мыши embyronic для того, чтобы замедлить нежелательные спонтанную дифференцировку ЭСК культур. Таким образом, фидерных клеток, используемых в чЭСК расширения должны быть удалены в процессе дифференцировки экспериментов. Хотя несколько методов, доступных для очистки чЭСК сотрудничестваlonies (FACS, Mac, или использование лекарственной устойчивостью векторов) от кормушки, эти методы являются трудоемкими, дорогостоящими и / или разрушительной для ЭСК. Целью этого проекта было придумать способ очистки, который позволяет уборки чище населения ЭСК. Мы обнаружили, что в сливной культуре ЭСК, население MEF могут быть удалены с помощью простого и быстрого стремления лист MEF. Это удаление зависит от нескольких факторов, включая боковые клетки к клетке связывания MEFs, которые имеют более низкое сродство к стирола блюдо культуры, а также возможность колоний стволовых клеток нажать на фибробласты наружу во время создания своего собственного " нишу ". ЧЭСК затем были исследованы на SSEA-4, Oct3 / 4 и Тра 1-81 выражении до 10 дней после удаления MEF для обеспечения поддержания плюрипотентности. Кроме того, ЭСК колонии были в состоянии продолжать расти с в более крупные образования после удаления MEF, обеспечивая дополнительный уровень чЭСК расширения.
Protocol
1. Подготовка мышиных эмбриональных Кормушки MEFs, используемых в совместной культуре ЭСК должна быть ранее получавших облучение или Митомицин-C для подавления клеток от прохождения дивизии. За два часа до посева MEF, пальто каждые 60 мм плазмы рассматривается культуры блюдо с 2 ?…
Discussion
Метод, представленный в этой рукописи предлагает быстрое и менее дорогостоящей альтернативой ликвидации фибробластов подачи из человеческих эмбриональных клеточных культурах. Успешное удаление фибробластов зависит от существования тесно сливающийся монослой из этих клеток, котор?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Новый факультет премии II из Калифорнийского института регенеративной медицины (RN2-00921-1), и NIH-финансируемые Национальной премии исследований (F32-HL104924)
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments (optional)
DDR2
Santa Cruz
7555
Fibroblast Marker
Dapi
Calbiochem
268298
Cell Nucleus Marker
SSEA-4
Millipore
MAB4304
Human ESC Marker
Oct 3/4
Santa Cruz
9081
Human ESC Marker
Flk-1
BD Pharma
555307
Early Differentiation Marker
Tra-1-81
Acris
AM20377AF4-S
Human ESC Marker
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
Turner, W. S., McCloskey, K. E. Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures. J. Vis. Exp. (68), e3951, doi:10.3791/3951 (2012).