Summary
Geçiş kültürlere besleyici-özgür koşullarda devam eden çabalarına rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve türetme ve kültürü fare embriyonik besleyiciler (MEFS) ile işbirliği kültürler büyük oranda bağımlı kalır. Burada, biz hızla öncesi deneylere hESC kültürlerden besleyiciler kaldırmak için yeni bir metodoloji göstermektedir.
Abstract
Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) blastosist izolasyonu 1 sonra insan embriyonik kök hücreleri (hESC) kültürler kurmak için kullanıldı. Bu besleyici sistem hücre genişleme sırasında spontan farklılaşma geçiren gelen hESC korur. Ancak, bu ko-kültür yöntemi, emek yoğun bir yüksek eğitimli personel gerektirir ve verimleri düşük hESC saflık 4. Birçok laboratuar hESC kültürlerinde besleyici hücrelerin sayısının (yani matriks kaplı yemekleri veya diğer besleyici hücre tipleri 5-8 birleşmeyle) en aza indirmek için çalışmışlardır. Bu modifiye edilmiş kültür sistemlerinin bazı söz göstermiştir, ancak mitomisin C ile tedavi edilen fare embyronic fibroblast ile kültür hESC hESC kültürlerin istenmeyen spontan farklılaşma geciktirmek amacıyla için standart yöntem üstlenilmekle değil. Bu nedenle, hESC genişleme kullanılan besleyici hücrelerin farklılaşması deneyler sırasında kaldırılması gerekir. Çeşitli teknikler HESC eş saflaştırılması için kullanılabilir olmasına rağmenserme lonies (FACS, MACS veya ilaca dirençli vektörlerin kullanımı), bu teknikler emek, yoğun masraflı ve / veya hESC için zararlıdır. Bu proje hedefi hESC daha saf bir nüfusun Hasat sağlayan saflaştırılması için bir yöntem bulmak olmuştur. Biz birleşik hESC kültür, MEF nüfus MEF levha basit ve hızlı bir aspirasyon kullanılarak temizlenebilir olduğunu gözlemledim. Bu kaldırma "yanal hücre-hücre stiren kültür çanak için daha düşük bir afiniteye sahip MEFS bağlayıcı ve kendi üretimi sırasında dışa fibroblastlar itmek için kök hücre kolonilerinin yeteneği dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır niş ". HESC sonra pluripotency devamını sağlamak için MEF uzaklaştırıldıktan sonra 10 gün için SSEA-4, Oct3 / 4 ve Tra 1-81 ifade için incelendi. Ayrıca, hESC koloniler hESC genişleme ek bir düzeyde sağlayan, MEF çıkarıldıktan sonra daha büyük oluşumların içine büyüyen devam başardık.
Protocol
1. Fare Embriyonik Besleyiciler hazırlanması
- HESC eş-kültür kullanılan MEFS önceden uygulanan bölünme gelen hücreleri inhibe etmek için ışınlama veya mitomisin-C tedavi edilmelidir.
- MEF ekim öncesi iki saat, mont, her 60 mm plazma% 0.05 Jelatin 2 ml kültür çanak tedavi.
- Bir tedavi MEFS bir flakon ve ~ 20.000 hücre / cm 2 plaka çözülme.
- Hücreleri gecede uymak için izin ver.
2. MEFS üzerine Co-tohumlama hESC
- Yeni koloniler aşağıdaki gibi, yeni MEF kaplı yemekleri üzerine kriyoprezerve kültürleri veya pasajı mevcut kültürlerden gelen başlatılabilir.
- Isıtılmış 1x 3 mL PBS ile 1 saat pasajlanmağa devam edilmesi için büyük hESC koloniler içeren plakayı yıkayın.
- Kollajenaz IV / PBS çözeltisi (1 mg / ml), 3 ml ekleyin ve 5-10 dakika 37 ° C de inkübe (Not: hücreleri, ayrı veya topu gibi tripsin ile görülen girmeyeceğim).
- Hücrelerinde ise halakollajenaz, 5 ml'lik pipet ucunun bir kenarı kullanmak, küçük hücreli kümeleri içine kırarak, koloniler üzerinde bir ızgara deseni oluşturun.
- Yüzeyinden bütün hücrelerin yerini değiştirmemek, kültür plakasının alt sıyırmak için pipet ucu (kültür levhasına dik bir şekilde tutulan) ucunu kullanımı.
- 5 dakika boyunca (1000 rpm) bir Falcon tüp ve spin içine hücreleri toplayın.
- Santrifüjlemeden sonra, Falcon tüp içinde hücre peleti bırakarak, orta aspire.
- Önce MEFS kaplama günden itibaren MEF orta aspire.
- Yeniden plaka orjinal plaka, 1:3 oranında hücreleri, ve HESC orta 3 ml yem
3. Co-kültür MEFS İncelten
Not: İnsan ESC kültürlerinin kültür genellikle 10 ile 14 gün arasında, yüksek yoğunlukta olması gerekir.
- Levha kenarına bir aspirasyon pipet ucu yerleştirin ve emme yavaşça EMB kenarından yukarı çekmek için izin verir.
- Rçanak, ortam kaydının silinmesi, ve uç levha hücre yakalamak ve yavaş yavaş plaka üzerinde bir yay biçimli bir şekilde uç hareket etmesini sağlar. Not: levha pipet ucu da tıkanmasına neden olur, ancak el kültür plakasının yüzeyinden levha çekerek kullanıcı engel olmamalıdır olarak bu sorun teşkil etmez. Hücreleri aspiratör ucuna sıkışmış iseniz, size tam aspirasyon için hücre sac kırmak için kültür çanak üst kullanabilirsiniz.
- Hemen hESC orta değiştirin ve inkübatör geri tabak koydu.
4. Temsilcisi Sonuçlar
MEF kaldırma işleminin Sonuçta küçük bozulmamış hESC pluripotency yapımcıları SSEA-4 ekspresyonu korurken çok büyük koloniler (Şekil 2) içine önemli bir genişleme geçmesi mümkün koloniler (Şekil 1D), Eki ¾ ve Tra 1-81 (Şekil üretir 3).
Şekil 1. ESC Koloni morfolojisi MEF kaldırılmasını Öncesi ve Sonrası. Kültür kaplarına üzerine tohumlama sonrası A) 1. gün ve B) günde 2 İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonileri. C) Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonileri (H7) MEFS çevrilidir. İki hESC koloniler kırmızı çizgiler içinde özetlenmiştir. D) açıklanan aspirasyonu tekniğini kullanarak MEF çıkarıldıktan sonra, biz sağlam koloni çevreleyen çok az MEFS izole bir hESC kolonisi ile bırakılır.
Şekil 2. 10 gün MEF kaldırılmasını sonra ESC Colony Genişleme. Hemen MEF tükenmesi sonrasında orijinal hESC koloni (solda) çok büyük bir koloni (sağda) beğenme içine genişletmek için izin verilir10x ximately 800 um. Orijinal koloninin kompozit kolonisi olarak aynı büyütme (10x) de görüntülü unutmayın.
Şekil 3,. MEF-tüketilmiş hESC koloniler immün. Kolonilerin immünofloresan kimlik kadar MEF tükenmesi 10 gün sonra sömürge Ekim ¾ SSEA-4 göre belirgin olarak pluripotency belirteçlerin ekspresyonu ve Tra-1-81 boyanma korumak olduğunu gösterir. Ayrıca, bu hESC koloniler, mezodermal kader karşı türev sergilemez, FLK-1 yokluğu ile gösterilir., A, E, I, ve M) immunoflouscently lekeli koloniler, 20, 10, 10 ve 2x transmisyon ışığı görüntüler, .. sırasıyla B, F, J ve K) çekirdekler gösterir - sırasıyla immunofluorescently lekeli koloniler, 20, 10, 10 ve 2x, CD) DAPI boyalı hücrelerin ifadesi gösteriyorinsan kök hücre belirteci yalnızca SSEA-4, ve kompozit görüntü, 20x. GH) insan kök hücre belirteci Ekim ifadesi gösteriyor ¾ sadece ve kompozit görüntü, 10x. KL) insan kök hücre belirteci ifadesi Tra sadece 1-81 göster ve kompozit görüntü, 10x. MP) son satırı görüntüler bu büyütme, 2x ve bu koloniler görülen tipik düzgün sınırlar tasvir bir koloni tasvir değilse ekspres Ç) FLK-1, mezoderm farklılaşma erken bir göstergesi, ne de did DDR2 boyama yokluğu ile gösterildiği gibi bu P) herhangi bir fibroblastlar içerir.
Ek video. Sheet Aspirasyon tarafından Fibroblastlar kaldırılıyor. filmi görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda sunulan yöntem, insan embriyonik hücre kültürlerinden fibroblast besleyici hücreler ortadan kaldırmak için hızlı ve az masraflı bir alternatif sunuyor. Fibroblastların başarılı kaldırılması artık kök hücre kültürlerinde gelişen bu hücrelerin sıkıca konfluent Monolayer varlığına bağlıdır. 7-10 gün sonra büyüyen hESC koloniler koloniler arasında giderek yoğun fibroblast monolayer üreten, dışa doğru besleyici fibroblastlar itecektir. Fibroblast monolayer içindeki güçlü hücre-hücre ekleri bir hücre tabaka olarak hızlı bir şekilde çıkarılmasını sağlar. Bu saflaştırma tekniği önce rutin kültürü için kullanılan büyüme değil yalnızca deney için HESC dan MEF uzaklaştırılması için bir yöntem olarak kullanım için önerilmektedir ki dikkatli bir şekilde belirtmek gerekir.
Bu kalitesiz kök hücre kolonileri kurtarmak için bu arındırma tekniği de yararlanmak mümkündür. Yüksek kaliteli hESC kolonisi Disti Katılmalıkendilerini ve besleyici hücreler arasındaki sınırların NCT. Bununla birlikte, kök hücre kolonileri daha sonra bu yöntem ayrıca EMB hücre levha ile birlikte kısmen farklı hESC koloniler kaldırmak için kullanılabilir daha az iyi tanımlanmış sınırlar koloni, ile hESC koloniler bununla beraber, fiziksel ayırma gösteren, kısmi türev geçirmiş halinde Bir pipet ucu istenmeyen farklılaşmış hücre veya MEF ile herhangi hESC bağlantıları ayırmak için gerekli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Rejeneratif Tıp California Institute (RN2-00921-1) ve bir NIH tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Ödülü (F32-HL104924) bir Yeni Fakülte Ödülü II tarafından finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.
