Summary
Malgré les efforts en cours pour les cultures de transition vers d'alimentation sans conditions, la dérivation et la culture de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) restent largement tributaires des co-cultures avec mangeoires embryonnaires de souris (MEF). Ici, nous montrons une nouvelle méthodologie pour éliminer rapidement départs à partir de cultures de CSEh avant l'expérimentation.
Abstract
Souris fibroblastes embryonnaires (MEF) ont été utilisés pour établir des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) après l'isolement des cultures blastocyste 1. Ce système d'alimentation maintient CSEh à partir de subir une différenciation spontanée lors de l'expansion cellulaire. Cependant, cette méthode de co-culture demande beaucoup de travail, nécessite un personnel hautement qualifié, et la pureté des rendements CSEh faible 4. De nombreux laboratoires ont tenté de minimiser le nombre de cellules nourricières dans les cultures de CSEh (c.-à matrice incorporant boîtes revêtues ou d'autres types de cellules nourricières 5-8). Ces systèmes de culture modifiés ont montré une certaine promesse, mais n'ont pas supplanté la méthode standard pour la culture des CSEh avec la mitomycine C traités par les fibroblastes de souris embyronic afin de retarder indésirables différenciation spontanée des cultures de CSEh. Par conséquent, les cellules nourricières utilisés dans l'expansion de CSEh doivent être retirés au cours d'expériences de différenciation. Bien que plusieurs techniques sont disponibles pour la purification de la coopération CSEhlonies (FACS, MACS, ou l'utilisation de vecteurs résistants aux médicaments) de mangeoires, ces techniques demandent beaucoup de travail, coûteux et / ou destructive à l'CSEh. L'objectif de ce projet était d'inventer une méthode de purification qui permet la récolte d'une population pure de CSEh. Nous avons observé que dans une culture confluente CSEh, la population MEF peut être enlevé en utilisant une aspiration simple et rapide de la feuille MEF. Cette suppression est tributaire de plusieurs facteurs, y compris latéral de cellule à cellule de liaison de MEF qui ont une faible affinité de liaison à la boîte de culture styrène, et la capacité des colonies de cellules souches à pousser les fibroblastes vers l'extérieur lors de la génération de leurs propres " niche ». Le CSEh ont ensuite été examinés pour SSEA-4, Oct3 / 4 et Tra 1-81 expression jusqu'à 10 jours après le retrait du MEF pour assurer le maintien de la pluripotence. En outre, les colonies de CSEh ont été en mesure de poursuivre sa croissance dans de grandes formations après le retrait du MEF, offrant un niveau supplémentaire de l'expansion sur les CSEh.
Protocol
1. Préparation des mangeoires embryonnaires de souris
- La FAE utilisé dans la co-culture des CSEh doivent être préalablement traités par irradiation ou mitomycine-C pour inhiber les cellules en cours de division de.
- Deux heures avant le semis, MEF, manteau chaque plasma de 60 mm boîte de culture traitée avec 2 ml de 0,05% de gélatine.
- Décongeler une fiole de traité MEF et la plaque à ~ 20.000 cellules / cm 2.
- Permettre aux cellules d'adhérer nuit.
2. Co-ensemencement CSEh sur les MEF
- De nouvelles colonies peut être initiée à partir de cultures cryoconservés ou repiquage des cultures actuelles sur de nouveaux MEF boîtes revêtues, comme ci-dessous.
- Laver la plaque contenant les colonies de CSEh grandes pour être repiquées 1 fois avec 3 ml de PBS 1x réchauffé.
- Ajouter 3 ml de collagénase IV / solution de PBS (1 mg / ml) et incuber pendant 5-10 min à 37 ° C. (Remarque: Les cellules ne deviennent distincts ou ballon comme on le voit par la trypsine).
- Bien que les cellules sont encore encollagénase, l'utilisation d'un bord d'un embout de pipette 5 ml, de créer un motif de grille sur les colonies, les casser en petits amas cellulaires.
- Utiliser l'extrémité de la pointe de pipette (tenue de façon perpendiculaire à la plaque de culture) pour racler le fond de la plaque de culture, déloger toutes les cellules de la surface.
- Recueillir les cellules dans un tube Falcon et de spin au (1000 rpm) pendant 5 min.
- Après centrifugation, aspirer le milieu, laissant le culot cellulaire dans le tube Falcon.
- Aspirer le milieu MEF MEF de l'plaquée la veille.
- Re-plaque les cellules à un ratio de 1:3 de la plaque d'origine, et se nourrissent avec 3 ml de milieu de CSEh
3. Appauvrissant la FAE de la co-culture
Remarque: l'homme cultures ESC doit être à haute densité, généralement entre 10 et 14 jours de culture.
- Placez l'extrémité d'une pipette d'aspiration sur le bord de la plaque et permettre l'aspiration pour tirer doucement le bord de la feuille MEF.
- ReMove les médias du plat et laissez la pointe d'attraper la feuille de cellules et déplacer lentement la pointe d'une manière arquée au-dessus de la plaque. Remarque: La feuille peut obstruer à la pointe de la pipette, mais ce n'est pas problématique, car elle ne doit pas empêcher l'utilisateur de tirer manuellement la feuille de la surface de la plaque de culture. Si les cellules sont collées à la fin de l'aspirateur, on peut utiliser la partie supérieure de la boîte de culture à rompre la feuille de cellules pour l'aspiration terminée.
- Remplacer immédiatement moyenne CSEh, et mettre la plaque arrière dans l'incubateur.
4. Les résultats représentatifs
Le résultat final de la procédure de suppression MEF produit de petites colonies de CSEh non perturbées (figure 1D) pouvant subir une expansion significative en très grandes colonies (figure 2), tout en maintenant l'expression des décideurs pluripotence SSEA-4, oct ¾, et Tra 1-81 (Figure 3).
Figure 1. La morphologie des colonies ESC Avant et après le retrait du MEF. Embryonnaires humaines colonies de cellules souches à un jour) 1 et B) le jour 2 après le semis sur des boîtes de culture. C) haute densité Embryonnaires humaines colonies de cellules souches (H7) entouré par MEF. Les deux colonies de CSEh sont présentées en pointillés rouges. D) Après le retrait du MEF en utilisant la technique d'aspiration décrits, on se retrouve avec une colonie isolée CSEh avec très peu MEF entourant la colonie intacte.
Figure 2. Expansion Colony ESC 10 jours après le retrait du MEF. La colonie CSEh d'origine immédiatement après l'épuisement du MEF (à gauche) est autorisé à augmenter en une colonie très importante (à droite) approassociés quelque 800 um, 10x. Noter que la colonie originale est reproduite au même grossissement (10x) comme la colonie composite.
Figure 3. Immunocoloration des colonies de CSEh MEF appauvries. Identification par immunofluorescence des colonies jusqu'à 10 jours après l'épuisement du MEF montre que les colonies maintenir leur expression de marqueurs de pluripotence comme évidente ici octobre ¾, SSEA-4 et Tra-1-81 coloration. En outre, ces colonies de CSEh ne présentent pas de différenciation vers un destin mésodermique, indiqué par l'absence de Flk-1. A, E, I et M) sont des images de transmission de la lumière des colonies immunoflouscently tachés, 20, 10, 10 et 2x, . respectivement B, F, J et N) montrent les noyaux -. cellules DAPI colorés de colonies par immunofluorescence tachés, 20, 10, 10 et 2x, respectivement CD) montrent l'expression dehumaine marqueur de cellules souches SSEA-4 uniquement, et l'image composite, 20x. GH) montrent l'expression de cellules souches humaines marqueur octobre ¾ seulement, et l'image composite, KL 10x.) montrent l'expression de marqueurs des cellules souches humaines Tra 1-81 seulement , et l'image composite, 10x. MP) La dernière ligne si les images représentent une colonie décrivant les frontières lisses typiques vus à ce grossissement, 2x, et ces colonies n'étaient pas expressément O) Flk-1, un marqueur précoce de la différenciation du mésoderme, ni ne ils P) contient aucun fibroblastes, comme indiqué par l'absence de coloration DDR2.
Vidéo supplémentaire. Retrait fibroblastes par aspiration de feuilles. Cliquez ici pour voir le film .
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Discussion
La méthode présentée dans ce manuscrit offre une alternative rapide et moins coûteux à éliminer les cellules nourricières de fibroblastes humains à partir de cultures de cellules embryonnaires. La suppression réussie de fibroblastes est subordonnée à l'existence d'une monocouche serrée confluente de ces cellules qui se développe en plus des cultures de cellules souches. Après 7-10 jours, les colonies de CSEh croissance va pousser les fibroblastes nourriciers vers l'extérieur, générant une monocouche de fibroblastes de plus en plus dense entre les colonies. Les solides de cellule à cellule pièces jointes dans la monocouche de fibroblastes permettre le retrait rapide comme une feuille de cellules. Il faut bien noter que cette technique de purification est proposé pour une utilisation en tant que méthode d'élimination MEF de CSEh avant l'expérimentation seulement, et ne sont pas utilisées pour la culture expansion de routine.
Il est également possible d'utiliser cette technique de purification pour sauver pauvres colonies de cellules souches de qualité. Une colonie de haute qualité CSEh doivent présenter DistiNCT frontières entre eux et les cellules nourricières. Si, toutefois, les colonies de cellules souches ont subi une différenciation partielle, présentant moins frontières des colonies bien définies, alors cette méthode peut également être utilisé pour enlever les colonies de CSEh différenciées partiellement avec la couche de cellules MEF, cependant, la séparation physique des colonies de CSEh avec une pointe de pipette peut être nécessaire de séparer les connexions avec les CSEh différenciées des cellules indésirables ou MEF.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par une nouvelle Faculty Award II du California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), et un prix financée par les NIH National de la Recherche (F32-HL104924)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
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