Summary
microvascular 크기의 채널 (<30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다. 이
Abstract
microfabrication 기술의 발전은 마이크로 및 nanoscales 1,2에서 생물 학적 및 생화 학적 실험을 수행을위한 저렴하고 재현성 microfluidic 시스템의 생산을 활성화했습니다. 또한, microfluidics도 구체적으로 인해 쉽게 역동적인 유체 환경과 생물 학적 조건 3-6 제어하는 능력 때문에, 양적 hematologic과 microvascular 프로세스를 분석하는 데 사용되었습니다. 따라서 연구자들은 최근 혈액 세포 deformability, 혈액 세포 집합, microvascular 혈액 흐름과 혈액 세포 - 내피 세포 상호 작용 6-13 공부를 microfluidic 시스템을 사용 해왔다. 그러나 이러한 microfluidic 시스템이 어느 교양 내피 세포를 포함하거나 더 큰 줄 몰랐 microvascular pathologic 프로세스 sizescale 관련된보다. 교양 내피 세포와 microfluidic 플랫폼 정확 recapitulates 세포, 물리적, 그리고 hemodyn 그microcirculation의 amic 환경 microvasculature 참여 hematologic 질환의 근본적인 biophysical pathophysiology 우리의 이해를 촉진하기 위해 필요합니다.
여기서는 hematologic 질환에서 발생 pathologic biophysical microvascular 상호 작용을 연구하기위한 표준 내피 세포 배양 기술과 함께 간단한 단일 마스크 microfabrication 프로세스를 사용하여 microvasculature의 체외 모델에서 "endothelialized"를 만드는 방법을보고합니다. 이것은 "microvasculature - 온 - 칩"단단히 생물학뿐만 아니라 biophysical 조건 제어와 표준 주사기 펌프 및 brightfield / 형광 현미경을 사용하여 운영하고 강력한 분석과 연구자를 제공합니다. 이러한 microcirculatory의 hemodynamic 조건, 내피 세포 유형, 혈액 세포 유형 (들)과 집중 (들), 마약 / 억제 농도 등 같은 매개 변수는 쉽게 제어할 수 있습니다. 따라서 우리의 microsystem 제공양적 microvascular 흐름이 때문에 세포 접착, 집합, 그리고 deformability, 기존 assays 함께 사용할 수없는 기능의 변경 사항에 장애되는 질병 프로세스를 조사하는 방식입니다.
Protocol
1. 내피 Microdevice의 제작
- 외부 마스크 공급 업체로 microfluidic 장치의 컴퓨터 보조 설계 (CAD) 도면을 제출하여 photomask를 만듭니다. 사용한 마스크는 소다 석회 유리에 크롬 층으로 구성되었다. 이 경우에는 microfluidic 채널 폭 30 μm의했습니다.
- 15 분 동안 고생과 베어 실리콘 웨이퍼 (황산과 과산화수소의 10시 1분 비율)을 청소하고 30 초 동안 불화 수 소산 산성에서 찍었 다. 약 10 초 동안 deionized (DI) 물로 씻어.
- 30 μm의 높이로 웨이퍼쪽으로 스핀 coater를 이용하여 스핀 Microchem SU-8 2,025 포토 레지스트. SU-8 2025의 경우 3000 RPM의 회전 속도 권장합니다. SU-8의 다른 viscosities이 높이를 달성하는 가능합니다. SU-8 사용에 대한 전체 안내를보실 수 있습니다 www.microchem.com
- 95 ° C에서 열판에 SU-8로 웨이퍼를 놓으십시오5 분 초과 용매를 운전합니다.
참고 : 오븐은 열판 다르게 웨이퍼를 건조하게 될 것입니다 것은 권장되지 않습니다. - 웨이퍼 위에 원하는 기능 형상과 마스크를 삽입하고, 자외선 (160 MJ / ㎝ 2로 노출 마스크 aligner (칼 조사할, MA-6)에서) 365 nm의에서 측정. 이 십자가는 포토 레지스트를 연결.
- 추가 SU-8의 중합을 촉진하기 위해 추가로 5 분 95 ° C에서 열판 다시 웨이퍼를 놓습니다.
- 비 교차 연결된 SU-8을 제거하려면 4 분간 PGMEA (프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트)로 주로 구성되어 SU-8의 개발자의 웨이퍼를 담궈.
- 10의 100 % 이소 프로필 알콜 (IPA)와 함께 새로 개발된 웨이퍼를 씻어. 웨이퍼 그런 다음 용매 몇 분 동안 깨끗한 퓸 후드의 웨이퍼에서 증발 수있게하거나 가압 질소를 사용하여 건조 수 있습니다.
- 테이프 배양 접시에 패턴 SU-8로 건조 웨이퍼의 가장자리는 사전하기운동을 빼낼.
- 웨이퍼 전체 코팅을 보장하기 위해 페트리 접시 위에, 그리고 소용돌이 모양의 웨이퍼와 커버, 피펫을 사용하여 웨이퍼에 Sigmacote 1 ML을 적용, 덮개를 제거하고 모든 용매가 증발된 때까지 웨이퍼 몇 분 동안 건조 수 있습니다.
2. PDMS (Polydimethylsiloxane) 준비
- 믹스 PDMS 폴리머와 경화 에이전트 10시 1분 비율 (W / W)에서하고 진공 건조기를 사용하여 기포를 제거합니다. 가스를 제거하다 PDMS에 필요한 시간의 길이는 가능한 진공 시스템의 강도에 따라 다르지만 일반적으로 몇 분 거리에 1 시간 범위. 내용은없고 이전에 부어 PDMS, 고분자의 60 ML의 총 볼륨으로 인해 저는 수십 인치 배양 접시 권장합니다.
- 약 5mm 두께의 웨이퍼에 혼합물을 부어. 또한 PDMS의 얇은 시트를 만드는 평평한 바닥 접시 위에 두께 약 1mm를 붓는다. 60 하룻밤 오븐에 ° C로 치료하자.
- 칼이나 메스를 사용하여 C 주위를 잘라PDMS 장치를 ured 및 웨이퍼에서 제거할 수 있습니다. 또한, 장치보다 약간 큰 PDMS의 얇은 시트를 잘라.
- 1.0 밀리미터 구멍 펀치를 사용하여 PDMS 장치의 유입구와 배출구 구멍을 만듭니다. 이 중 핀 바이스, 해리스 유니 코어, 또는 이와 유사한 장치를 사용하여 수행할 수 있습니다.
- 장치의 표면과 스카치 테이프를 사용하여 시트를 청소합니다.
- 플라즈마 클리너 사용, PDMS 장치에서 30 s에 대한 산소 플라즈마에 PDMS 시트의 표면을 쉽게받을 수 있습니다. 산소 플라즈마는 신체 접촉으로 데려 결합 PDMS의 노출된 표면에 반응 수종을 만듭니다.
- PBS의 인간 혈장 50 μg / ML fibronectin 가득 바람에 무딘 점 바늘 주사기에 연결된 대형 튜브의 작은 길이 (몇 센티미터),에 작은 튜브를 연결합니다. 관 그리고 바늘이 마찰 맞춤 튜브 사이에 만들어 졌는지와 같은 크기입니다. 작은 PDMS microdevice의 입구에있는 튜브와를 삽입pply 주사기에 압력 fibronectin 솔루션을 완벽하게 채널을 기입하고 배출구 포트에 작은 100 μL 방울을 만들려면 채널이 젖었 머물 수 있도록. 40-60 분 동안 37 ° C에서 장치를 품어.
- 무딘 포인트 바늘로 PBS로 가득 신선한 주사기를 연결합니다. PBS로 장치를 헹굴 수있는 주사기에 압력을 적용합니다.
3. 내피 세포와 Microfluidic 장치를 퍼뜨리고
- 8퍼센트 dextran과 내피 성장 미디어에서 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs)의 1,000,000 세포 / ML을 준비합니다. 500,000까지 2,000,000 세포 / ML의 범위가 성공적으로 사용되었습니다. 셀 로딩 매체에 dextran의 추가들은 fibronectin - 코팅 microfluidic 시스템 입력으로 내피 세포의 속도가 감소 유체의 점도를 증가시킵니다. 이것은 차례로, 세포가 microdevice 내에 성공적으로 준수 문화 것이라는 확률이 높아집니다.
- C단계 2.7에서와 같이 새로운 주사기와 튜브를 onnect. 하지만 긴 튜브로 (길이 약 1 미터).
- 이 시스템의 성능을 최적화하기 위해서는 전체를 관류 시스템에 누출이나 거품을 방지하기 위해이 시점에서 중요하다, 솔루션 또는 미디어의 거품의 존재의 누설이 흐름을 변경하고 내피 세포의 성공적인 시딩를 방지할 수 있습니다. 따라서 튜브가 꽉 피팅은 어떤 연결 사이의 누설을 제거하는 것이 필수적이다. 세포 microdevice 도입하고 전체를 관류 시스템은 공기 방울의 도입을 피하기 위해 microfluidic에 튜브를 장착하기 전에 셀 솔루션으로 끝났다해야하기 전에 주사기 및 / 또는 튜빙의 거품은 제거되어야합니다.
- 주사기 펌프를 사용하여, 37에서 2 시간 동안 1.23 μl / 분 용적식 속도로 PDMS 장치에 세포 현탁액을 불어 넣다 ° C에서 5 % CO 2. 주사기 펌프에 있었을 때 최적의 결과를 달성했다 PDMS 장치로 같은 높이. 입구 들어, 인큐베이터 안에 낫게 수있는 긴 튜브는 세포와 미디어가 적절 장치와 접촉 오기 전에 워밍업하는 보장합니다. 저희 시스템에서는 1.23 μl / 분의 체적 유량은 중 ~ 1 다인 / 전체 혈액을 사용하는 채널의 cm 2. 벽면 전단 응력에 대응하는 가장 작은 microchannels에 ~ 1mm / s의 강물의 한복판 속도를 대략
- 1.23 μl / 분 비율로 2~8일에 대해 동일한 주사기 펌프 및 긴 튜브, perfuse 신선한 성장 미디어를 사용합니다. 성공적인 장치는 24-48 시간 이내에 장치의 내부에 성장 내피 세포 단일층을해야합니다. 이전 실험 합류 monolayers 적절하게 기기에 걸쳐 14 세포 - 세포 분기점에서 VE-cadherin을 표현하는 것으로 나타났습니다.
- 실험을위한 시스템으로 혈액이나 세포 현탁액을 주사.
4. 대표 결과
_content가 ">이 프로토콜을 사용하여 표준 리소그래피 microfabrication 기법은 생리학 microvasculature (그림 1A)의 sizescale을 모방 microfluidic 채널을 생성하는 데 필요한 금형을 만드는 데 사용됩니다. 최적화된 관류 기법을 사용하여 내피 세포가 종자 및 confluently 문화 microfluidic 시스템이 투명으로 세포 시딩의 24 ~ 48 시간 내 microfluidic 시스템 (그림 1B)의 전체 내부 표면은., 전체 microdevice는 이미징 및 데이터 수집을위한 brightfield / 형광 현미경 스테이지에 둘 수 있습니다.우리의 시스템은 다음 sickled 붉은 세포 탈선 백혈구 및 내피 접착의 증가 강성은 microvascular 장애물에 기여하는 등 낫 세포 질환과 같은 biophysical 속성, 변경 포함 hematologic 질환을 연구에 적용할 수 있습니다. 임상적으로 승인된 약물 치료, hydroxyurea는 증상이 있지만 D를 amelioratesmicrovascular 흐름에 irect 효과는 알 수 없습니다. 우리의 분석은 계정의 셀 강성과 접착 모두로 소요되며, hydroxyurea가 크게 낫 세포 질환 (그림 2)에서 흐름을 ameliorates 것을 보여줍니다.
이 시스템은 이상적인 혈액 세포가 microvasculature에서 서로와 내피 세포와 상호 작용하는 모든 hematologic 과정을 공부하고 적합으로 낫 세포 질병은 microvasculature - 온 - 칩위한 응용 프로그램의 한 예입니다. 더 기본적인 애플 리케이션이 많은 사람 중에서 백혈구 생물학과 조혈 줄기 세포 생물학을 포함하면서 기타 임상 관련 애플 리케이션은 염증성 질환, 패혈증 / 폐 상해, thrombotic microangiopathies, 말라리아, 그리고 암 전이를 포함합니다.
그림 1.) endothelialization 전에 초기 PDMS microfluidic 장치. 여기 microdevice는 재치가 주입된다H 식품 시스템의 sizescale 및 전반적인 디자인을 설명하기 착색. B) Brightfield 현미경은 microfluidic 체제가 완전히 여기에서 설명한 프로토콜을 사용하여 세포 시딩 48 시간 이내에 endothelialized되어 보여줍니다.
그림 2.) microchannels있는 microvasculature - 온 - 칩은 사후 모세관 venules (30 μm의), 대부분 낫을 세포 microvascular 폐쇄 이벤트 사이트의 크기를 대략. hydroxyurea를받는 낫 셀 환자에서와 hydroxyurea를받지 못한 환자의 전체 혈액은 두 개의 서로 다른 microvasculature - 온 - 칩 디바이스를 통해 흘러됩니다. endothelialized microchannels 내에서 상대적으로 쉽게 hydroxyurea 흐름을 받고 낫 셀 환자에서 B) 전체 혈액. C) 같은 hemodynamic 조건에서 hydroxyurea를받지 못하고 낫 셀 환자에서 전체 혈액 그러나, microch와 훨씬 더 부진한 흐름을 전시하고annel의 방해. 아래 채널이 완전히없이 흐름에 방해되고 다른 endothelialized microchannels의 흐름 판매율은 hydroxyurea 조건에 비해 현저히 낮은됩니다. 세 가지 이미지 스케일 바는 30 μm의입니다.
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Discussion
우리 endothelialized microdevice 시스템은 생체내 실험에서와 함께 사용할 때 가장 좋은 적합하며, reductionist 접근 방식은 인간과 동물 모델에서 관찰되는 hematologic 프로세스 biophysical 메커니즘을 명료하게하다 도움이 될 수 있습니다. 또한, 우리의 시스템은 제한없이 않습니다. 예를 들어, 우리 microfluidic 채널 단면에서 사각형입니다. 기술적으로 원형 microchannels는 10,11를 조작 수 있지만, 우리는 다른 연구자들이 쉽게 자신의 작품이 시스템을 적용할 수 있도록보다 단순하고 일반 제조 절차를 사용하기로했다. 또한, 효과적인 루멘 "밖으로 반올림 '교양 내피 세포가 자연의 존재는 시스템이 더 physiologic 될 수 있도록. 또한, 우리의 유체 다이나믹 모델링은 우리 시스템의 유량 조건 생체내 microvasculature의 입은 비교는 것을 알 수있다. 마지막으로, 최근 작품은 광장에서 혈액 흐름을 특성화D 직사각형의 microchannels 그 형상은 혈액 레올로지 실험 15 적합한 것으로 나타났습니다.
마지막으로, 우리의 분석은 고립에서 microvascular의 폐색으로 이어질 별개의 세포 biophysical 속성을 측정하기위한 것이 아닙니다. 이러한 원자 힘 현미경, micropipette의 열망, 광학 트래핑과 같은 기법이 잘 실험 이러한 유형의 특징되었습니다. 대신, 우리의 microsystem의 가치가 동시에 체외 시스템에서 하나의 유착 분자 발현, 탈선 혈액 세포 - 내피 세포 상호 작용, 혈액 세포 집합 (예 : 혈전증을 포함한 생리적 프로세스와 biophysical 속성의 앙상블 이내, 요점을 되풀이하는 자사의 능력입니다 ), 다른 질병 상태에 pathologic microvascular 세포 상호 작용에 기여하는 모든 중 휴대 deformability, 세포 크기 / 모양, microvascular 기하학, 그리고 혈류 역학.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 T. 헌트 M. Rosenbluth, 그들의 조언과 유용한 토론 램 연구소 감사드립니다. 우리는 G. 스피너의 지원과 기술 조지아 연구소의 전자 및 나노 테크놀로지 연구소를 인정합니다. 이 작품에 대한 재정 지원은 NIH 교부금 K08-HL093360, UCSF REAC 상, NIH의 Nanomedicine 개발 센터 수상 PN2EY018244, 그리고 애틀랜타의 어린이 건강의 내피 세포 생물학을위한 센터에서 자금 지원에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
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