Summary
Mikrovasküler ölçekli kanallar (<30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu
Abstract
Imalat teknikleri gelişmeler mikro ve nanoscales 1,2 'de biyolojik ve biyokimyasal deneyler için ucuz ve tekrarlanabilir mikroakışkan sistemleri üretim sağlamıştır. Buna ek olarak, aynı zamanda spesifik olarak Mikroakiskan nedeniyle kolayca dinamik bir akışkan ortam ve biyolojik şartlar 3-6 kontrol etme konusunda, kantitatif hematolojik ve mikrovasküler süreçler kullanılarak analiz edilmiştir. Gibi araştırmacılar, son zamanlarda kan hücrelerinin şekil, kan hücre agregasyonu, mikrovasküler kan akımı ve kan hücre-endotel hücre etkileşimleri 6-13 incelemek için mikroakışkan sistemleri kullandık. Ancak, bu mikroakışkan sistemler ya kültürlü endotel hücreleri içeren veya büyüktü vermedi mikrovasküler patolojik süreçleri sizescale ilgili daha. Kültürlü endotel hücreleri ile mikroakışkan platformu doğru özetlediği hücresel, fiziksel ve hemodyn bumikrodolaşımında Amic ortamı mikrovasküler içeren hematolojik hastalıkların temel biyofiziksel patofizyolojisi anlayışımızı ilerletmek için gereklidir.
Burada, hematolojik hastalığı meydana patolojik biyofiziksel mikrovasküler etkileşimleri çalışmak için standart endotel hücre kültür teknikleri ile birlikte, basit bir, tek bir maske mikroimalat sürecini kullanarak, mikrovasküler bir in vitro model "endothelialized" oluşturmak için bir yöntem sunduk. Bu "mikrovasküler-on-a-chip" sıkı biyolojik hem de biyofiziksel koşulları kontrol ve standart bir şırınga pompası ve aydınlık / floresan mikroskobu kullanarak işletilmektedir sağlam bir yöntem ile araştırmacı sağlar. Böyle mikrosirkülatuar hemodinamik şartlar, endotel hücre tipi, küre tipi (ler) ve konsantrasyon (s), ilaç / inhibitör konsantrasyonu, vs gibi parametreler her kolayca kontrol edilebilir. Bu, bizim mikrosistem sağlarkantitatif mikrovasküler akış nedeniyle hücre adezyon, agregasyon ve deformabilitesi, mevcut testler ile ulaşılamıyor bir yeteneği değişikliklerden engelli olduğu hastalık süreçleri araştırmak için bir yöntem.
Protocol
1. Endotel mikrocihazda Fabrikasyon
- Dışarıdan bir maske satıcıya mikroakışkan cihazın bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) çizim göndererek bir photomask oluşturun. Kullanılan maske soda kireç camına bir krom tabakası oluşuyordu. Bu durumda mikroakışkan kanalın eni 30 mikron olmuştur.
- 15 dakika boyunca piranha sahip çıplak silikon (sülfürik asit ve hidrojen peroksit 10:01 oranında) temizlemek ve 30 saniye boyunca hidroflorik asit eğimlidir. Yaklaşık 10 saniye deiyonize (DI) su ile durulayın.
- 30 mikron yüksekliğinde gofret üzerine bir spin lak kullanılması, spin Microchem SU-8 2025 fotorezist. SU-8 2025, 3000 rpm arasında bir dönüş hızı tavsiye edilir. SU-8 diğer viskoziteler Bu yüksekliğe ulaşmak hangi mevcuttur. SU-8 kullanmak için Tam talimatlar mevcuttur www.microchem.com
- Için 95 ° C'de bir ocak gözünde SU-8 ile gofret yerleştirin5 dakikadan fazla çözücü kovmak için.
Not: Bir fırın, bir ocak gözünün farklı gofret kurulayın ve edecektir tavsiye edilmez. - Gofret üzerinde istenilen özelliği şekli ile bir maske yerleştirin ve UV ışık (160 mj / cm 2 maruz Bir maske hizalama (Karl süß, MA-6)) 365 nm'de ölçülür. Bu çapraz fotorezist bağlar.
- Daha da SU-8 polimerizasyon hızlandırmak için ek bir 5 dakika süreyle 95 ° C 'de bir ısı plakası üzerine geri gofret yerleştirin.
- Olmayan bir çapraz bağlı SU-8 kaldırmak 4 dakika boyunca PGMEA (propilen glikol metil eter asetat) ile esas olarak oluşan SU-8 Developer gofret, batırmak.
- 10 sn için% 100 izopropil alkol (IPA) sahip yeni geliştirilen gofret çalkalayın. Gofret ve sonra solvent birkaç dakika için temiz bir çeker ocak içinde gofret buharlaşmasına izin vererek veya basınçlı nitrojen kullanılarak kurutulur.
- Teyp bir petri kaplarına desenli SU-8 ile kuru gofret kenarlarına öncesi içinhareketi için önlem alınmalıdır.
- Gofret tam kaplama sağlamak için petri üst ve girdap gofret ile kapağı, bir pipet kullanarak gofret için Sigmacote 1 mL uygulayın, kapağını kaldırın ve tüm çözücü çekinceye kadar gofret, birkaç dakika kurumasını bekleyin.
2. PDMS (polidimetilsiloksan) hazırlanması
- Mix PDMS polimer ve sertleştirici 10:1 oranı (w / w) az ve bir vakum desikatörde kullanarak hava kabarcıklarını çıkarmak. Gazını almak PDMS için gerekli olan zamanın uzunluğu, kullanılabilir vakum sisteminin gücüne göre değişir, ancak genellikle birkaç dakika ile bir saat arasında değişmektedir. Için bir önceden döküldü PDMS, polimerin 60 mL toplam hacim ile altı inçlik petri tavsiye edilir.
- Yaklaşık 5 mm kalınlığında, gofret üzerine karışımı dökün. Ayrıca, PDMS ince bir tabaka oluşturmak için, düz dipli çanak üzerine yaklaşık 1 mm kalınlığında dökün. 60 gece boyunca bir fırında ° C'de tedavisi.
- Bir bıçak ya da bistüri kullanarak, c etrafında kesipPDMS cihaz edili ve gofret çıkarın. Buna ek olarak, cihaz, biraz daha büyük PDMS ince bir tabaka kesilir.
- 1.0 mm delik kullanarak PDMS cihazın giriş ve çıkış delikleri oluşturun. Bu da iğne mengenesi, Harris Uni-Core veya benzer bir cihaz kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- Cihazın yüzeyler ve seloteyip kullanılarak levha temizlenir.
- Ve plazma kullanılarak, PDMS aygıtı ve 30 saniye bir oksijen plazmaya PDMS tabakanın yüzeyi maruz bırakmaktadır. Oksijen plazma fiziksel temas ettirilir bağı PDMS açıkta kalan yüzeyi üzerinde reaktif türün oluşturur.
- PBS içinde insan plazmasından 50 ug / ml fibronektin ile doldurulmuş sırayla bir küt-noktası iğne ile bir şınngaya bağlanmış bir çok tüp küçük bir uzunluğu (birkaç santimetre), daha küçük boru bağlanır. Tüp ve iğne bir sürtünme uygun borular arasında oluşturulan bu tür ölçekli vardır. Küçük PDMS mikrocihazda girişinde boru ve eklemepply şırıngaya basınç fibronektin çözeltisi ile tamamen kanalları doldurmak için ve çıkış deliği küçük bir 100 uL damla oluşturmak için, kanallar ıslak kalmasını sağlamak için. 40-60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe cihazı.
- Künt noktaya iğne için PBS ile dolu yeni bir şırınga bağlayın. PBS ile cihaz durulama şırıngaya basınç uygulayın.
3. Endotel Hücreleri ile mikroakışkan Aygıt tohumlama
- % 8 dekstran ile endotelyal büyüme ortamında insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'lere) 1.000.000 hücre / ml hazırlayın. 500.000 ile 2.000.000 hücre / ml Bir dizi başarıyla kullanılmaktadır. Hücre yükleme orta dekstran ilavesiyle bunlar fibronektin kaplı mikroakışkan sistemi girerken endotel hücrelerinin hızı azalır sıvısı, viskozitesi arttırır. Bu da, hücrelerin mikrocihazda içinde başarıyla yapışır ve kültür olasılığını artırır.
- CAdım 2.7 gibi yeni şırınga ve tüp onnect. fakat daha uzun bir boru ile (uzunluk yaklaşık 1 metre).
- Bu sistemin performansını optimize etmek için, tüm perfüzyon sisteminde herhangi bir sızıntı veya kabarcıklarını engellemek için bu noktada önemlidir, çözüm ya da medyada kabarcıklarının varlığı herhangi bir sızıntı akışını değiştirebilir ve endotelyal hücrelerin başarılı tohumlama önleyecektir. Bu nedenle, boru sıkı uyan herhangi bir bağlantıları arasındaki sızıntıyı ortadan kaldırmak için gereklidir. Hücreleri mikrocihazda tanıtıldı ve tüm perfüzyon sistemi hava kabarcıklarının giriş önlemek için mikroakışkan tüp takmadan önce hücre çözümü ile astarlanmalıdır önce şırınga ve / veya boru Bubbles ortadan kaldırılmalıdır.
- Bir şırınga pompası kullanılarak, 37 de 2 saat için 1.23 ul / dak akış hızında hacimsel PDMS aygıtı içine hücre süspansiyonu aşılamak ° C'de ve% 5 CO2. Şırınga pompası olduğu zaman iyi sonuçlar elde edildi PDMS aygıtı olarak aynı yükseklikte. Girişi için inkübatöre içinde sarmal olabilir uzun tüp, hücreler ve medya yeterince cihazı ile temas öncesi ılıtıldı edilmesini sağlar. Bizim sistemde, 1.23 ul / dakika debili ~ 1 dyne / tam kan kullanarak bu kanalları cm 2. Bir duvar kayma gerilmesi karşılık küçük mikrokanallarda içinde ~ 1 mm / s orta akım hızı yaklaşık olarak
- 1,23 ul / dk oranında 2-8 gün boyunca aynı şırınga pompası ve uzun bir tüp, yayma taze büyüme ortamı kullanılarak. Başarılı bir cihaz 24-48 saat içinde aygıt iç büyüyen endotel hücreleri, bir tek tabakalı sahip olacaktır. Önceki deneyler konfluent mono tabakalar uygun bir cihaz 14 boyunca hücre-hücre kavşaklarda VE-cadherin ifade olduğunu göstermiştir.
- Deneysel sistem içine kan veya hücre süspansiyonu enjekte edilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
_content "> Bu protokol kullanılarak standart litografik imalat teknikleri fizyolojik olarak mikrovasküler (Şekil 1a) sizescale taklit mikroakışkan kanal üretmek için gerekli kalıp oluşturmak için kullanılır. optimize edilmiş bir perfüzyon tekniği kullanarak, endotel hücreleri daha sonra, tohum ve confluently kültürü mikroakışkan sistemi şeffaf olduğu için hücre ekimi 24-48 saat içinde mikroakışkan sistemi (Şekil 1B) tüm iç yüzünü., tüm mikrocihazda görüntüleme ve veri toplama için bir aydınlık / floresan mikroskop sahnede yerleştirilebilir.Sistemimiz daha sonra orak kırmızı hücreleri ve anormal lökosit ve endotel adezyon artan sertlik mikrovasküler obstrüksiyon katkıda bulunduğu gibi orak hücre hastalığı gibi biyofiziksel özellikleri, değiştirilemez barındırır hematolojik hastalıklar çalışma uygulanabilir. Klinik olarak onaylanan ilaç, hidroksiüre, belirtiler ancak d düzeltirmikrovasküler akımı üzerine irect etkisi bilinmemektedir. Bizim test hesabı hücre sertliği ve yapışma hem de içine alır ve hidroksiüre önemli orak hücre hastalığı (Şekil 2) akış düzeltir olduğunu gösteriyor.
Bu sistemin ideal kan hücrelerinin mikrovasküler birbirlerine ve endotel hücreleri ile etkileşim içinde herhangi bir hematolojik süreci incelemek için uygundur gibi orak hücre hastalığı, mikrovasküler-on-a-chip için bir uygulama sadece bir örnektir. Daha temel uygulamaları pek çok diğerleri arasında lökosit biyoloji ve hematopoetik kök hücre biyolojisi, yer alırken, diğer klinik uygulamalar inflamatuar hastalıklar, sepsis / akciğer hasarı, trombotik mikroanjiopatilerdir, sıtma ve kanser metastazı içerir.
Şekil 1. A) endothelializasyona önce, başlangıç PDMS mikroakışkan cihazı. Burada, mikrocihazda wit enjekte edilirh gıda sisteminin sizescale ve genel tasarımı göstermek için boyama. B) aydınlık mikroskobu mikroakışkan sistemi tamamen burada açıklanan protokolü kullanılarak hücre ekiminin 48 saat içinde endothelialized gösterir.
Şekil 2. A) mikrokanallar ile mikrovasküler-on-a-chip post-kapiller venüller (30 mikron), en orak hücreli mikrovasküler obstrüktif olayların sitenin boyutu yakındır. Hidroksiüre alan orak hücre hastalarında ve hidroksiüre almayan hastalardan tam kan iki farklı mikrodolaşımını-on-a-chip cihazlar üzerinden akar. Endothelialized mikrokanallar içinde göreli kolaylıkla hidroksiüre akımlarının alan orak hücre hastalarında B) Tam kan. C) aynı hemodinamik şartlar altında, hidroksiüre almayan orak hücre hastalardan alınan kan, bununla birlikte, microch ile çok daha yavaş akış sergileyenannel tıkanıklığı. Alt kanalı tamamen hiçbir akışı ile engellenmiş ve diğer endothelialized mikrokanallardaki akım hızları hidroksiüre durumda önemli ölçüde daha düşüktür edilir. Her üç görüntüler ölçek çubuğu 30 mikron olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim endothelialized mikrocihazda sistemi in vivo deneyler ile birlikte kullanıldığında en uygun olan, ve indirgemeci bir yaklaşım, insan ve hayvan modellerinde gözlenen hematolojik süreçlerinin biyofiziksel mekanizmaları aydınlatmak yardımcı olabilir. Ayrıca, sistem sınırlamaları olmaksızın değildir. Örneğin, bizim mikroakışkan kanal kesitinin kare vardır. Teknik dairesel mikrokanallar 10,11 imal edilebilir olsa da, diğer araştırmacılar kolayca kendi çalışmaları için bu sistemi uygulamak için izin vermek için bir daha basitleştirilmiş ve standart üretim yordamı kullanmak için seçti. Buna ek olarak, etkili bir lümeninin "çıkışı yuvarlak" kültürü endotel hücreleri, doğal varlığında sistemi daha fizyolojik olarak sağlayarak. Ayrıca, bir sıvı dinamiğiyle modelleme Sistemimizde akış koşulları vivo mikrovasküler alanda karşılaştırılabilir olduğunu ortaya koymaktadır. Son olarak, son iş kare bir kan akışı karakterized dikdörtgen mikrokanallarda bu geometriler kan reoloji deneyler 15 için uygun olduğunu göstermiştir.
Son olarak, test, izolasyon, mikrovasküler oklüzyon yol belirgin hücresel biyofiziksel özelliklerini ölçmeye yönelik değildir. Gibi atomik kuvvet mikroskobu, mikropipet aspirasyon ve optik yakalama gibi teknikler de deneyler bu tür için karakterize edilmiştir. Bunun yerine, bizim mikrosistem değeri aynı anda ve in vitro sistemde tek bir adezyon molekül, anormal kan hücresi-endotel hücre etkileşimleri, kan hücrelerinin (örneğin trombozu gibi fizyolojik süreçler ve biyofiziksel özellikleri, bir topluluk içinde, özetlemek için yapılabilir ), farklı hastalık durumlarında patolojik mikrovasküler hücresel etkileşimleri katkıda bulunan tüm bunların hücre deformabilite, hücre boyutu / şekil, mikrovasküler geometri ve hemodinami,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz T. Hunt, M. Rosenbluth ve onların tavsiye ve faydalı tartışmalar için Lam Lab teşekkür ederim. Biz G. Spinner gelen destek ve Teknoloji Georgia Institute Elektronik ve Nanoteknoloji Enstitüsü kabul ediyorsunuz. Bu çalışma için maddi destek bir NIH hibe K08-HL093360, UCSF REAC ödül, bir NIH Nanotıp Geliştirme Merkezi Ödülü PN2EY018244 ve Atlanta Çocuk Sağlık ve Endotel Hücre Biyolojisi Merkezi'nden fon tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I.
- Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
