Summary
Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (<30 pm) beschreven. Deze
Abstract
De vooruitgang in microfabricage technieken hebben het mogelijk de productie van goedkope en reproduceerbare microfluïdische systemen voor het uitvoeren van biologische en biochemische experimenten op micro-en nanoschaal 1,2. Daarnaast zijn microfluidics ook specifiek gebruikt om kwantitatief te analyseren hematologische en microvasculaire processen, vanwege hun vermogen om eenvoudig controle de dynamische vloeibare milieu en biologische omstandigheden 3-6. Als zodanig hebben de onderzoekers meer recent gebruikt microfluïdische systemen bloedcellen vervormbaarheid, bloedcel aggregatie, microvasculaire doorbloeding, en bloed cel-endotheliale cel interacties 6-13 te bestuderen. Echter, deze microfluïdische systemen ofwel geen rekening gehouden met gekweekte endotheelcellen of waren groter dan sizescale relevante microvasculaire pathologische processen. Een microfluïdische platform met gekweekte endotheelcellen die nauwkeurig recapituleert de cellulaire, fysieke en hemodynAmic omgeving van de microcirculatie is nodig om ons begrip van de onderliggende biofysische pathofysiologie van hematologische ziekten die de microvasculatuur te betrekken bevorderen.
Hier melden wij een methode om een "endothelialized" te creëren in vitro model van de microvasculatuur, met behulp van een eenvoudige, enkel masker microfabricage proces in combinatie met standaard endotheelcellen cultuur technieken, om pathologische biofysische microvasculaire interacties die plaatsvinden in de hematologische ziekte te bestuderen. Deze "microvasculatuur-on-a-chip" biedt de onderzoeker met een robuuste test die goed bestuurt zowel biologische als biofysische voorwaarden en wordt bediend met een standaard spuit pomp en helderveld / fluorescentie microscopie. Parameters zoals microcirculatie hemodynamische omstandigheden, endotheelcellen type bloedcel type (n) en de concentratie (s), drugs / remmende concentratie etc. kunnen allemaal eenvoudig te bedienen. Als zodanig is onze microsysteem biedteen methode om kwantitatief te onderzoeken ziekte processen waarin microvasculaire doorstroming wordt belemmerd als gevolg van veranderingen in celadhesie, aggregatie, en vervormbaarheid, een vermogen beschikbaar met bestaande tests.
Protocol
1. Fabricage van de endotheliale microdevice
- Maak een masker door het indienen van een computer assisted design (CAD) tekening van de microfluïdische apparaat aan een externe leverancier masker. De gebruikte masker bestond uit een chroomlaag op glas natronkalk. In dit geval microfluïdische kanaalbreedte was 30 pm.
- Reinigen van een kale siliciumplak met piranha (10:01 verhouding van zwavelzuur en waterstofperoxyde) gedurende 15 minuten dopen in fluorwaterstofzuur 30 seconden. Spoelen met gedeïoniseerd (DI) water gedurende ongeveer 10 seconden.
- Een rotatie coater, spin Microchem SU-8 2025 fotoresist op de wafer een hoogte van 30 pm. Voor SU-8 2025, is een spin toerental van 3000 rpm aanbevolen. Andere viscositeiten van SU-8 zijn die de hoogte te bereiken. Volledige instructies voor het SU-8 gebruik zijn beschikbaar op www.microchem.com
- Plaats de wafer SU-8 op een kookplaat bij 95 ° C5 minuten rijden overtollige oplosmiddel.
Opmerking: Een oven zal de wafer anders te drogen dan een kookplaat en wordt niet aanbevolen. - Plaats een masker met de gewenste functie vorm over de wafer, en blootstellen aan UV-licht (160 mJ / cm 2 gemeten bij 365 nm) met een masker richteenheid (Karl Suss MA-6). Dit kruis verbindt de fotolak.
- Plaats de wafer op een kookplaat bij 95 ° C nog 5 minuten te versnellen de polymerisatie van SU-8.
- Dompel de wafer in SU-8 ontwikkelaar, voornamelijk uit PGMEA (propyleen glycol methyl ether acetaat) gedurende 4 minuten aan de niet-verknoopte SU-8 verwijderen.
- Spoel nieuw ontwikkelde wafer met 100% isopropylalcohol (IPA) gedurende 10 s. De wafer kan dan worden gedroogd met behulp van druk stikstof of doordat het oplosmiddel van het plaatje in een schone zuurkast verdampen enkele minuten.
- Tape de randen van de droge wafer patroon SU-8 in een petrischaal voorafontluchten beweging.
- Breng 1 ml Sigmacote de wafer met een pipet met de bovenkant van de petrischaal en swirl wafer volledige bekleding van de wafer zorgen deksel te verwijderen, en laat wafer drogen enkele minuten tot alle oplosmiddel verdampt.
2. PDMS (Polydimethylsiloxaan) Voorbereiding
- Mix PDMS polymeer en katalysator in een 10:01 verhouding (w / w) en luchtbellen te verwijderen met een vacuumexsiccator. De tijd die nodig is om ontgas de PDMS varieert de sterkte van de beschikbare vacuümsysteem, maar gewoonlijk varieert van enkele minuten tot een uur. Een zes inch petrischaal zonder vooraf gegoten PDMS, een totaal volume van 60 ml polymeer wordt aanbevolen.
- Giet het mengsel op de wafer, ongeveer 5 mm dik. Ook giet op een vlakke bodem schotel om een dunne plaat van PDMS te maken, ongeveer 1 mm dik. Uitharden bij 60 ° C in een oven gedurende de nacht.
- Met behulp van een mes of scalpel, uitgesneden rond de creerd PDMS-apparaat en verwijder deze uit de wafer. Bovendien gesneden een dunne PDMS iets groter dan de toestel.
- Maak in-en uitlaat gaten in de PDMS-apparaat via een 1,0 mm gat punch. Dit kan worden bereikt met behulp van een pen vice, Harris Uni-Core, of iets dergelijks.
- Reinig het oppervlak van het apparaat en de plaat met behulp van plakband.
- Een plasma reiniger bloot de oppervlakken van de PDMS apparaat PDMS beschrijving aan zuurstofplasma 30 s. De zuurstofplasma ontstaat reactieve op het blootgestelde oppervlak van de band die PDMS wanneer het in aanraking.
- Verbinding kleinere buis met een lengte (enkele centimeters) van grote buizen, die op zijn beurt een injectiespuit verbonden met een stompe punt naald, gevuld met 50 ug / ml fibronectine uit humaan plasma in PBS. De buis en de naald zijn zodanig gedimensioneerd dat een wrijvingspassing wordt tussen de buizen. Plaats kleinere slangen in de inlaat van PDMS microdevice en eenPas toe druk aan de injectiespuit volledig vullen van de kanalen met fibronectine oplossing en een kleine 100 pi druppelsgewijs de afvoeropening maken, dat de kanalen nat blijven. Incubeer de inrichting bij 37 ° C gedurende 40-60 minuten.
- Sluit een verse injectiespuit gevuld met PBS om de stompe punt naald. Oefen druk uit op de spuit om het apparaat te spoelen met PBS.
3. Seeding de microfluïdische apparaat met endotheelcellen
- Bereid miljoen cellen / ml humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC's) in endothelial growth media met 8% dextran. Een reeks van 500.000 tot 2.000.000 cellen / ml met succes gebruikt. Toevoeging van dextran de cel geladen medium verhoogt de viscositeit van de vloeistof, die de snelheid van endotheelcellen afneemt wanneer zij het met fibronectine gecoate microfluïdische systeem. Dit op zijn beurt, de kans dat de cellen hechten en met succes cultuur in de microdevice.
- Cluit de nieuwe spuit en slangen zoals in stap 2.7. maar met een langere buis (ongeveer 1 meter).
- Om optimaliseren van dit systeem, is het essentieel op dit punt voorkomen lekken of luchtbellen in het gehele perfusiesysteem, lekkage oplossing of de aanwezigheid van luchtbellen in de media de stroom veranderen en voorkomen succesvolle zaaien van endotheelcellen. Daarom, strakke montage van de slang is essentieel om lekkage tussen de aansluitingen te elimineren. Bubbles in de spuit-en / of leidingen moeten worden verwijderd voordat cellen worden geïntroduceerd in de microdevice en het hele perfusie systeem moet worden geprimed met de cel oplossing voor het bevestigen van de slang aan op de microfluïdische de invoering van luchtbellen te voorkomen.
- Met een spuit pomp trekken celsuspensie in PDMS inrichting op volumestroom van 1,23 pl / min gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Optimale resultaten werden verkregen wanneer de injectiespuit pomp was op de dezelfde hoogte als de toestel PDMS. Voor de inlaat langere buis, die kan worden opgerold binnen de couveuse, zodat de cellen en media voldoende verwarmd voordat ze in contact met het apparaat. In ons systeem de volumestroom van 1,23 pl / min benadert een halverwege snelheid van ~ 1 mm / s in de kleinste microkanalen, overeenkomend met een afschuifspanning van ~ 1 dyne / cm 2 op de kanalen van bloed.
- Met dezelfde spuitpomp lange slangen doorstroomd vers kweekmedium voor 2-8 dagen verhouding van 1,23 pl / min. Een succesvolle apparaat een monolaag van endotheelcellen groeien op de binnenzijde van de machine binnen 24-48 uur. Eerdere experimenten hebben aangetoond dat confluente monolagen juiste VE-cadherine uiten cel-juncties in de inrichting 14.
- Injecteer bloed of celsuspensie in het systeem te experimenteren.
4. Representatieve resultaten
_content "> Met dit protocol standaard lithografische microfabricage technieken worden gebruikt om de matrijs nodig microfluïdische kanalen die fysiologisch bootsen de sizescale van de capillairen (figuur 1A) produceren maken. behulp van een geoptimaliseerde perfusietechniek, endotheelcellen dan zaden en confluently cultuur de gehele binnenkant van de microfluïdische systeem binnen 24-48 uur van cel zaaien (Figuur 1B). Aangezien het microfluïdische systeem transparant is, kan de hele microdevice geplaatst worden op een helderveld / fluorescentiemicroscoop podium voor beeldvorming en het verzamelen van gegevens.De kan dan worden toegepast hematologische aandoeningen die betrekken veranderd biofysische eigenschappen zoals sikkelcelziekte, waarbij de verhoogde stijfheid van sickled rode cellen en afwijkende leukocyten en endotheliale adhesie bijdragen tot microvasculaire obstructie bestuderen. Een klinisch goedgekeurde medicijnen, hydroxyurea, verzacht de symptomen maar de directe effect op microvasculaire stroom is onbekend. Onze test houdt rekening met zowel de cel stevigheid en hechting, en toont aan dat hydroxyurea aanzienlijk doorstroming verbetert bij patiënten met sikkelcelanemie (figuur 2).
Sikkelcelziekte is slechts een voorbeeld van een toepassing voor de microvasculatuur-on-a-chip, omdat dit systeem is uitermate geschikt voor een hematologische proces waarin bloedcellen met elkaar omgaan en endotheelcellen in de microvasculatuur te bestuderen. Andere klinisch relevante toepassingen zijn onder meer inflammatoire aandoeningen, sepsis / long schade, trombotische microangiopathies, malaria, en kanker metastase, terwijl meer fundamentele toepassingen zijn onder meer leukocyten de biologie en de hematopoietische stamcellen biologie, onder vele anderen.
Figuur 1. A) de eerste PDMS microfluïdische apparaat voordat endothelizatie. Hier wordt de microdevice geïnjecteerd humorh kleurstof aan sizescale en de algehele vormgeving van het systeem te illustreren. B) helderveld microscopie toont de microfluïdische systeem volledig endothelialized binnen 48 uur van cel zaaien met behulp van het protocol hier beschreven.
Figuur 2. A) De microvasculatuur-on-a-chip met microkanalen benadert de omvang van de post-capillaire venulen (30 micrometer), de site van de meeste sikkelcel microvasculaire obstructieve evenementen. Volbloed van sikkelcel patiënten die hydroxyurea en van patiënten die geen hydroxyurea wordt doorstroomd twee verschillende microvasculatuur-on-a-chip-apparaten. B) volbloed van sikkelcel patiënten die hydroxyurea stromen relatief gemakkelijk binnen de endothelialized microkanalen. C) Onder dezelfde voorwaarden hemodynamische, volbloed van sikkelcel patiënten die geen hydroxyurea, maar vertoont nog veel meer trage stroom met microchannel obstructie. De onderste kanaal is volledig geblokkeerd met geen stroming en de stroomsnelheden in de andere endothelialized microkanalen zijn aanzienlijk lager dan in de hydroxyurea conditie. De schaalstaaf in de drie beelden is 30 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De endothelialized microdevice wordt best in combinatie met in vivo experimenten en zijn reductionistische benadering kan helpen verhelderen de biofysische mechanismen hematologische processen die bij de mens en diermodellen. Bovendien is ons systeem is niet zonder beperkingen. Zo onze microfluïdische kanalen vierkante dwarsdoorsnede. Hoewel technisch ronde microkanalen kunnen worden vervaardigd 10,11, hebben we ervoor gekozen om een eenvoudiger en standaard fabricage procedure te gebruiken, zodat andere onderzoekers dit systeem gemakkelijk toepassen op hun eigen werk. Bovendien is de aanwezigheid van de gekweekte endotheelcellen natuurlijk "completeert" effectieve lumen, zodat het systeem meer fysiologische. Bovendien onze vloeistof dynamische modellering blijkt dat de stroming in het systeem zijn vergelijkbaar met die in de in vivo microvasculatuur. Tot slot, recente werk het karakteriseren van de bloedstroom in vierkante eend rechthoekige microkanalen heeft uitgewezen dat deze geometrieën geschikt zijn voor het bloed reologie experimenten 15.
Tot slot wordt onze test niet bedoeld om te meten in de isolatie, verschillende cellulaire biofysische eigenschappen die leiden tot microvasculaire occlusie. Technieken zoals atomic force microscopie, micropipet aspiratie, en optische zetten van vallen zijn goed gekarakteriseerd voor deze typen experimenten. In plaats daarvan, de waarde van onze microsysteem is zijn vermogen om samen te vatten, gelijktijdig en binnen een in vitro systeem, een ensemble van fysiologische processen en biofysische eigenschappen, met inbegrip van adhesiemoleculen expressie, afwijkende bloedcellen-endotheliale cel interacties, bloedcel aggregatie (bijvoorbeeld trombose ), cel vervormbaarheid, cel grootte / vorm, microvasculaire geometrie en hemodynamica, die allemaal bijdragen aan pathologische microvasculaire cellulaire interacties in verschillende ziektebeelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken T. Hunt, M. Rosenbluth, en het Lam Lab voor hun advies en nuttige discussies. Wij erkennen de steun van G. Spinner en het Instituut voor elektronica en nanotechnologie van het Georgia Institute of Technology. Financiële steun voor dit werk werd geleverd door een NIH-subsidie K08-HL093360, UCSF REAC Award, een NIH Nanomedicine Development Center Award PN2EY018244, en de financiering van het Centrum voor Endothelial Cell Biology van de Children's Healthcare van Atlanta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
