Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering, kultur og manipulation af muse embryonale pancreas. Dette repræsenterer en fremragende<em> Ex vivo</em> System for at studere forskellige aspekter af bugspytkirtlen udvikling, herunder morfogenese, differentiering og vækst. Pancreas opløbet eksplantater kan dyrkes i flere dage og anvendes i en række forskellige applikationer, herunder hele-mount immunofluorescens og direkte billedvisning.
Bugspytkirtlen styrer vitale funktioner i vores krop, herunder produktion af fordøjelsesenzymer og regulering af blodsukkeret 1. Selv om der i det seneste årti mange undersøgelser har bidraget til et solidt grundlag for at forstå bugspytkirtlen organogenese, vigtige huller stadig i vores viden om tidlig pancreas formation 2. En fuldstændig forståelse af disse tidlige hændelser vil give indsigt i udviklingen af dette organ, men også ind i uhelbredelige sygdomme, der er målrettet bugspytkirtlen, såsom diabetes eller kræft i bugspytkirtlen. Endelig vil denne information generere en plan for udvikling af celle-udskiftning behandlingsformer i forbindelse med diabetes.
Under embryogenese, stammer bugspytkirtlen fra forskellige embryoniske udvækster på den dorsale og ventrale foregut endoderm på fosterdag (E) 9.5 i museembryo 3,4. Begge udvækster evaginate i det omgivende mesenkym som faststof epitell knopper, som undergår proliferation, forgrening og differentiering til at generere en fuldt moden orgel 2,5,6. Nylige beviser tyder på, at væksten og differentieringen af pankreatiske cellelinier, herunder de insulinproducerende β-celler, afhænger af korrekt vævs-arkitektur, epithelial remodellering og celle-placering i det forgrenings pancreas epitel 7,8. Men hvor forgrening morfogenese forekommer, og er koordineret med proliferation og differentiering i pancreas er stort set ukendt. Dette er til dels skyldes, at den nuværende viden om disse udviklingsprocesser har næsten udelukkende på en analyse af faste prøver, mens morfogenetiske begivenheder er meget dynamisk.
Her rapporterer vi en fremgangsmåde til at dissekere og dyrkning af muse embryonale pancreatisk buds ex vivo på glas bunden retter, som giver mulighed for direkte visualisering af det udviklende pancreas (figur 1). Denne kulture system er ideelt udtænkt til konfokal laserscanningsmikroskopi og især, live-cell imaging. Pancreas eksplantater kan fremstilles ikke blot af vildtype-museembryoer, men også fra gensplejsede musestammer (fx transgene eller knockout), hvilket muliggør tidstro studier af mutante fænotyper. Desuden er denne ex vivo-dyrkningssystemet er værdifuldt at undersøge effekten af kemiske forbindelser på pancreasudviklingen, gør det muligt at opnå kvantitative data om proliferation og vækst, forlængelse, forgrening, tubulogenesis og differentiering. Som konklusion, giver udviklingen af en ex vivo bugspytkirtlen eksplantat kultur metode kombineret med høj opløsning billeddannelse en stærk platform til at observere morfogenetiske og differentiering hændelser som de forekommer inden for udvikling museembryo.
Når bugspytkirtlen skæbne er angivet, pancreasstamfaderceller gennemgår omfattende proliferation, differentiering og morfogenese til sidst danne en moden og funktionel orgel 2,4. I øjeblikket finder hvordan forgrening sted i pancreas, og hvordan den er tilsluttet progenitor proliferation og differentiering er stort set ukendt. Pancreas eksplantatkulturer udgør et ideelt system til at belyse disse processer ex vivo 5,9,11. Ved at kombinere live-cell imaging med ex vivo eksplan…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i Den Spagnoli lab. er finansieret af Helmholtz Association, FP7-IRG-2008-ENDOPANC tilskud og ERC-2009-Start HEPATOPANCREATIC Grant.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
Watchmaker’s foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |