Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma excelente<em> Ex vivo</em> Sistema para estudar vários aspectos do desenvolvimento do pâncreas, incluindo a diferenciação morfogênese e crescimento. Explantes broto pancreático pode ser cultivada por vários dias e usado em uma variedade de aplicações diferentes, incluindo todo-mount imunofluorescência e imagem ao vivo.
O pâncreas controla as funções vitais do nosso corpo, incluindo a produção de enzimas digestivas e regulação dos níveis de açúcar no sangue 1. Embora na última década muitos estudos têm contribuído para uma fundação sólida para a compreensão organogênese pâncreas, importantes lacunas persistem em nosso conhecimento da formação do pâncreas precoce 2. Uma compreensão completa dos eventos iniciais vão fornecer informações sobre o desenvolvimento do órgão, mas também de doenças incuráveis que visam o pâncreas, como o diabetes ou câncer de pâncreas. Finalmente, esta informação vai gerar um modelo para o desenvolvimento de terapias de substituição de células no contexto da diabetes.
Durante a embriogénese, o pâncreas origina distintas excrescências embrionárias da endoderme foregut dorsal e ventral no dia embrionário (E) 9,5 no embrião de rato 3,4. Ambas as excrescências evaginate no mesênquima circundante como epitélios sólidobotões L, que se submetem a proliferação, diferenciação e ramificação para gerar um órgão totalmente madura 2,5,6. Evidências recentes sugerem que o crescimento e diferenciação de linhagens de células, incluindo pancreáticas produtoras de insulina das células β, depende do tecido adequado arquitetura remodelação, epitelial e posicionamento de célula dentro do epitélio pancreático ramificação 7,8. No entanto, como a ramificação ocorre morfogénese e é coordenada com a proliferação e diferenciação no pâncreas é em grande parte desconhecida. Isto é em parte devido ao facto de que o conhecimento actual sobre os processos de desenvolvimento baseou-se quase exclusivamente na análise de amostras fixadas, enquanto que os eventos morfogenéticos são altamente dinâmico.
Aqui, apresentamos um método para dissecar e cultura embrionárias de camundongos pancreático ex vivo gemas em pratos de vidro de fundo, o que permite a visualização direta do pâncreas em desenvolvimento (Figura 1). Este cultoure sistema está idealmente concebido para a microscopia confocal laser scanning e, em particular, de imagem ao vivo de células. Explantes pancreáticas podem ser preparados não apenas a partir de embriões de rato de tipo selvagem, mas também a partir de estirpes de murganhos geneticamente modificados (por exemplo transgénico ou knockout), permitindo tempo real estudos de fenótipos mutantes. Além disso, este sistema de cultura ex vivo é útil para estudar os efeitos de compostos químicos sobre o desenvolvimento pancreático, permitindo a obtenção de dados quantitativos sobre a proliferação e crescimento, alongamento, ramificação, tubulogenesis e diferenciação. Em conclusão, o desenvolvimento de um método de pâncreas ex vivo cultura explante combinada com imagens de alta resolução fornece uma plataforma forte para observar eventos morfogenéticos e diferenciação à medida que ocorrem dentro do embrião de rato em desenvolvimento.
Uma vez que o destino é especificado pancreático, de células progenitoras do pâncreas sofrer proliferação extensiva, a diferenciação e a morfogénese para eventualmente formar um órgão funcional maduro e 2,4. No presente, como a ramificação ocorre no pâncreas e como ele é ligado a proliferação e diferenciação de células progenitoras é em grande parte desconhecida. Culturas de explantes de pâncreas representa um sistema ideal para elucidar esses processos ex vivo 5,9,11.</sup…
The authors have nothing to disclose.
Research in Spagnoli laboratório. é financiado pela Associação Helmholtz, FP7-IRG-2008-ENDOPANC concessão e ERC-2009-Começando Grant hepatopâncreas.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
Watchmaker’s foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |