כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד, תרבות ומניפולציה של לבלב העוברי של עכבר. זה מייצג מצוין<em> Vivo לשעבר</em> מערכת ללימוד היבטים שונים של פיתוח לבלב, כולל המורפוגנזה, התמיינות וגדילה. explants ניצן הלבלב יכול להיות מתורבת במשך כמה ימים ולהשתמש במגוון של יישומים שונים, כולל כל הר-immunofluorescence והדמיה חייה.
הלבלב שולט בתפקודים חיוניים של הגוף שלנו, כולל ייצור של אנזימי עיכול ופיקוח על רמות סוכר בדם 1. אמנם בעשור האחרון מחקרים רבים תרמו ליסודות מוצקים להבנת organogenesis לבלב, פערים חשובים להתמיד בידע של היווצרות לבלב המוקדמת 2 שלנו. הבנה מלאה של האירועים המוקדמים הללו תספק תובנה לתוך הפיתוח של איבר זה, אלא גם למחלות חשוכות מרפא המתמקדות בלבלב, כמו סוכרת או סרטן הלבלב. לבסוף, את המידע הזה יפיק תכנית לפיתוח טיפולים להחלפת תא בהקשר של סוכרת.
במהלך התפתחות עוברת, הלבלב נובע מאוטופיות צמחה עובריות שונות של האנדודרם המעי הקדמי גב וגחון ביום עוברי (E) 9.5 בעבר עכבר 3,4. שני האוטופיות צמח evaginate לmesenchyme מקיף כepithelia מוצקניצני הליטר, שעוברים התפשטות, מסתעף ובידול לייצר איבר בגרות מלאה 2,5,6. העדויות האחרונות הראו כי צמיחה והתבדלות של תאי לבלב שושלות, כולל את β-תאים המייצרים אינסולין-, תלויות ברקמות ארכיטקטורת שיפוץ ראוי, אפיתל ומיצוב תא בתוך אפיתל לבלב הסתעפות 7,8. עם זאת, איך מסתעף המורפוגנזה מתרחשת ומתואם עם ריבוי ובידול בלבלב הוא ידוע ברובם. זה בחלקו בשל העובדה שהידע נוכחי על תהליכים התפתחותיים אלה הסתמך כמעט אך ורק על ניתוח של דגימות קבועות, תוך אירועים המוךפו"גנטי הם דינמיים מאוד.
כאן, אנו מדווחים שיטה לvivo culturing העכבר העוברי לבלב הניצנים לשעבר במנות תחתית זכוכית, המאפשרות הדמיה ישירה של לבלב הפיתוח (איור 1) ולנתח. כת זומערכת יור פתח באופן אידיאלי למיקרוסקופיה confocal סריקת הליזר, ובהדמיה בפרט, חי תאים. explants לבלב יכול להיות מוכן לא רק מעוברי עכברי סוג פראי, אלא גם מזני עכבר מהונדס גנטי (למשל מהונדס או נוקאאוט), המאפשר לימודים בזמן אמיתי של פנוטיפים מוטציה. יתר על כן, מערכת תרבות vivo לשעבר זה יקר כדי לחקור את ההשפעות של תרכובות כימיות על התפתחות לבלב, ומאפשר לקבל מידע כמוני על שגשוג וצמיחה, התארכות, הסתעפות, tubulogenesis והבחנה. לסיכום, הפיתוח של שיטת vivo לשעבר לבלב explant תרבות בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה מספק פלטפורמה חזקה להתבוננות אירועים המוךפו"גנטי ובידול כפי שהם מתרחשים בתוך עובר העכבר המתפתח.
ברגע שגורל לבלב מצוין, ותאי לבלב לעבור התפשטות נרחבת, בידול והמורפוגנזה סופו של דבר ליצירת איבר בוגר ותפקודי 2,4. נכון לעכשיו, איך ההסתעפות מתרחשת בלבלב ואיך זה קשור לריבוי מולידו ובידול היא במידה רבה לא ידוע. תרבויות explant לבלב מייצגות מערכת אידיאלית להבהיר תהליכ…
The authors have nothing to disclose.
מחקר ב Spagnoli המעבדה. ממומן על ידי אגודת הלמהולץ, FP7-IRG-2008-ENDOPANC המענק וגרנט HEPATOPANCREATIC ERC-2009 החל-.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
Watchmaker’s foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |