Her beskriver vi en fremgangsmåte for isolering, kultur og manipulering av mus embryonale bukspyttkjertelen. Dette representerer et utmerket<em> Ex vivo</em> System for å studere ulike aspekter av bukspyttkjertelen utvikling, inkludert morphogenesis, differensiering og vekst. Bukspyttkjertelen bud explants kan dyrkes i flere dager og brukes i en rekke forskjellige programmer, inkludert hel-mount immunfluorescens og live imaging.
Bukspyttkjertelen styrer vitale funksjoner i kroppen vår, inkludert produksjon av fordøyelsesenzymer og regulering av blodsukkeret en. Selv i det siste tiåret mange studier har bidratt til et solid fundament for å forstå bukspyttkjertelen organogenese, viktige hull vedvarer i vår kunnskap om tidlig bukspyttkjertelen formasjon 2. En fullstendig forståelse av disse tidlige hendelser vil gi innsikt i utviklingen av dette organet, men også i uhelbredelige sykdommer som er rettet mot bukspyttkjertelen, som diabetes eller kreft i bukspyttkjertelen. Til slutt, vil denne informasjonen generere en blåkopi for å utvikle celle-erstatning terapi i sammenheng med diabetes.
Under embryogenesen stammer bukspyttkjertelen fra forskjellige embryonale utvekster av dorsal og ventral forutgående endoderm på embryonale dag (E) 9.5 i musen embryo 3,4. Begge utvekster evaginate i det omkringliggende mesenchyme som solid epithelial knopper, som gjennomgår spredning, forgrening og differensiering for å generere et fullt moden organ 2,5,6. Nylige bevis har antydet at vekst og differensiering av bukspyttkjertelen celle linjene, inkludert insulin-produserende β-celler, avhengig av riktig vev-arkitektur, epitelisk ombygging og celle posisjonering innen den forgrenede bukspyttkjertelen epitel 7,8. Men hvordan forgrening morphogenesis oppstår og er koordinert med spredning og differensiering i bukspyttkjertelen er i stor grad ukjent. Dette er delvis på grunn av det faktum at dagens kunnskap om disse utviklingsprosesser har lettelse nesten utelukkende på analyse av faste prøver, mens morfogenetisk hendelser svært dynamiske.
Her, rapporterer vi en fremgangsmåte for dissecting og dyrking mus embryonale bukspyttkjertelen knopper ex vivo på glassbunn retter, som tillater direkte visualisering av fremkallende bukspyttkjertelen (figur 1). Denne kultenure systemet er ideelt utviklet for konfokal laserskanning mikroskopi og, i særdeleshet, live-celle bildebehandling. Pankreatisk eksplanter kan fremstilles ikke bare fra villtype mus embryoer, men også fra genmanipulerte muselinjer (f.eks transgen eller knockout), slik sanntidsdata studier av mutante fenotyper. Dessuten er denne ex vivo kultursystem verdifullt å studere effektene av kjemiske forbindelser på bukspyttkjertelen utvikling, slik å skaffe kvantitative data om spredning og vekst, forlengelse, forgrening, tubulogenesis og differensiering. I konklusjonen, gir utviklingen av en ex vivo bukspyttkjertelen eksplantering kultur metode kombinert med høy oppløsning en sterk plattform for å observere morfogenetisk og differensiering hendelser som de oppstår innenfor utvikling musen embryo.
Når bukspyttkjertelen skjebne er spesifisert, bukspyttkjertelen stamceller gjennomgår omfattende spredning, differensiering og morphogenesis til slutt danne en moden og funksjonell organ 2,4. I dag, tar hvordan forgreininger sted i bukspyttkjertelen, og hvordan den er koblet til stamcellemobilisering proliferasjon og differensiering er stort sett ukjent. Bukspyttkjertelen Eksplantasjon kulturer representerer et ideelt system for å belyse disse prosessene ex vivo 5,9,11. Ved å kombinere…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i den Spagnoli lab. er finansiert av Helmholtz Association, FP7-IRG-2008-ENDOPANC stipend og ERC-2009-Starter HEPATOPANCREATIC Grant.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
Watchmaker’s foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |