Ett system för<em> Ex vivo</em> Odling av embryonala Pancreas

Summary

Här beskriver vi en metod för isolering, kultur och manipulering av mus embryonala pankreas. Detta utgör en utmärkt<em> Ex vivo</em> För att studera olika aspekter av bukspottskörteln utveckling, inklusive morfogenes, differentiering och tillväxt. Pankreatiska knopp explantat kan odlas i flera dagar och användes i en rad olika tillämpningar, inklusive hel-mount immunfluorescens och levande bildåtergivning.

Abstract

Bukspottkörteln styr vitala funktioner i vår kropp, inklusive produktionen av matsmältningsenzymer och reglering av blodsockret ^1. Även under det senaste decenniet många studier har bidragit till en stabil grund för att förstå bukspottskörteln organogenesen, viktiga luckor kvar i vår kunskap om tidig bukspottkörteln bildas ^2. En fullständig förståelse av dessa tidiga händelser kommer att ge inblick i utvecklingen av detta organ, men också till obotliga sjukdomar som riktar bukspottkörteln, såsom diabetes eller cancer i bukspottkörteln. Slutligen kommer denna information genererar en plan för att utveckla cell-substitutionsbehandlingar i samband med diabetes.

Under embryogenes, kommer bukspottkörteln från distinkta embryonala utväxter av den dorsala och ventrala framtarmen endoderm vid embryonal dag (E) 9,5 i musembryot ^3,4. Båda utväxter evaginate in i den omgivande mesenkym som fast epitell knoppar, som genomgår förökning, förgrening och differentiering för att generera en fullt utvecklad orgel ^2,5,6. Nya bevis har föreslagit att tillväxt och differentiering av linjerna pankreatiska cell, inklusive de insulinproducerande β-celler, beroende korrekt vävnads-arkitektur, epitelial ombyggnad och cell positionering inom förgrening bukspottkörteln epitel ^7,8. Men hur förgrening morfogenes sker och samordnas med proliferation och differentiering i bukspottkörteln är i stort sett okända. Detta beror delvis på det faktum att dagens kunskap om dessa utvecklingsprocesser har förlitat nästan uteslutande på analys av fasta prover, medan morfogenetiska händelser är mycket dynamiska.

Här rapporterar vi en metod för att dissekera och odling mus embryonala knoppar pankreas ex vivo på rätter glas botten som gör direkt visualisering av utvecklingsländerna bukspottkörteln (figur 1). Denna kulture-systemet är idealiskt utformat för konfokal laserskanning mikroskopi och, i synnerhet, live-cell imaging. Pankreatiska explantat kan framställas inte bara från vildtyp musembryon, utan också från genetiskt modifierade musstammar (t.ex. transgena eller knockout), möjliggör realtid studier av mutanta fenotyper. Dessutom är denna ex vivo odlingssystem värdefullt att studera effekterna av kemiska föreningar på pankreatisk utveckling, gör det möjligt att erhålla kvantitativa data om proliferation och tillväxt, töjning, förgrening, tubulogenesis och differentiering. Sammanfattningsvis ger utveckling av en ex vivo bukspottskörteln explantat odlingsmetod i kombination med hög upplösning avbildning en stark plattform för att observera morfogenetiska och differentiering händelser när de inträffar i utvecklingsländerna musembryo.

Protocol

Protokollet som beskrivs här har anpassats från den teknik som ursprungligen beskrivs i Percival och Slack 9 och optimerad för konfokalmikroskopi. 1. Beläggning av kultur Glass Bottom rätter Följande steg bör utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva. Pankreatiska explantat odlas i 35-mm petriskålar med 20-mm glas mikrobrunn botten (t.ex. Mattek Corporation). Använd en maträtt glasbotten per explant…

Discussion

När pankreatisk öde anges, pankreatiska progenitorceller genomgår omfattande proliferation, differentiering och morfogenes för att slutligen bilda en mogen och fungerande organ ^2,4. För närvarande sker hur förgrening rum i bukspottkörteln och hur det är anslutet till stamfader proliferation och differentiering är i stort sett okänd. Pankreas explantation kulturer är ett idealiskt system för att belysa dessa processer ex vivo ^5,9,11. Genom att kombinera levande cell imaging med…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1