Summary

Ett system för<em> Ex vivo</em> Odling av embryonala Pancreas

Published: August 27, 2012
doi:

Summary

Här beskriver vi en metod för isolering, kultur och manipulering av mus embryonala pankreas. Detta utgör en utmärkt<em> Ex vivo</em> För att studera olika aspekter av bukspottskörteln utveckling, inklusive morfogenes, differentiering och tillväxt. Pankreatiska knopp explantat kan odlas i flera dagar och användes i en rad olika tillämpningar, inklusive hel-mount immunfluorescens och levande bildåtergivning.

Abstract

Bukspottkörteln styr vitala funktioner i vår kropp, inklusive produktionen av matsmältningsenzymer och reglering av blodsockret 1. Även under det senaste decenniet många studier har bidragit till en stabil grund för att förstå bukspottskörteln organogenesen, viktiga luckor kvar i vår kunskap om tidig bukspottkörteln bildas 2. En fullständig förståelse av dessa tidiga händelser kommer att ge inblick i utvecklingen av detta organ, men också till obotliga sjukdomar som riktar bukspottkörteln, såsom diabetes eller cancer i bukspottkörteln. Slutligen kommer denna information genererar en plan för att utveckla cell-substitutionsbehandlingar i samband med diabetes.

Under embryogenes, kommer bukspottkörteln från distinkta embryonala utväxter av den dorsala och ventrala framtarmen endoderm vid embryonal dag (E) 9,5 i musembryot 3,4. Båda utväxter evaginate in i den omgivande mesenkym som fast epitell knoppar, som genomgår förökning, förgrening och differentiering för att generera en fullt utvecklad orgel 2,5,6. Nya bevis har föreslagit att tillväxt och differentiering av linjerna pankreatiska cell, inklusive de insulinproducerande β-celler, beroende korrekt vävnads-arkitektur, epitelial ombyggnad och cell positionering inom förgrening bukspottkörteln epitel 7,8. Men hur förgrening morfogenes sker och samordnas med proliferation och differentiering i bukspottkörteln är i stort sett okända. Detta beror delvis på det faktum att dagens kunskap om dessa utvecklingsprocesser har förlitat nästan uteslutande på analys av fasta prover, medan morfogenetiska händelser är mycket dynamiska.

Här rapporterar vi en metod för att dissekera och odling mus embryonala knoppar pankreas ex vivo på rätter glas botten som gör direkt visualisering av utvecklingsländerna bukspottkörteln (figur 1). Denna kulture-systemet är idealiskt utformat för konfokal laserskanning mikroskopi och, i synnerhet, live-cell imaging. Pankreatiska explantat kan framställas inte bara från vildtyp musembryon, utan också från genetiskt modifierade musstammar (t.ex. transgena eller knockout), möjliggör realtid studier av mutanta fenotyper. Dessutom är denna ex vivo odlingssystem värdefullt att studera effekterna av kemiska föreningar på pankreatisk utveckling, gör det möjligt att erhålla kvantitativa data om proliferation och tillväxt, töjning, förgrening, tubulogenesis och differentiering. Sammanfattningsvis ger utveckling av en ex vivo bukspottskörteln explantat odlingsmetod i kombination med hög upplösning avbildning en stark plattform för att observera morfogenetiska och differentiering händelser när de inträffar i utvecklingsländerna musembryo.

Protocol

Protokollet som beskrivs här har anpassats från den teknik som ursprungligen beskrivs i Percival och Slack 9 och optimerad för konfokalmikroskopi. 1. Beläggning av kultur Glass Bottom rätter Följande steg bör utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva. Pankreatiska explantat odlas i 35-mm petriskålar med 20-mm glas mikrobrunn botten (t.ex. Mattek Corporation). Använd en maträtt glasbotten per explant…

Discussion

När pankreatisk öde anges, pankreatiska progenitorceller genomgår omfattande proliferation, differentiering och morfogenes för att slutligen bilda en mogen och fungerande organ 2,4. För närvarande sker hur förgrening rum i bukspottkörteln och hur det är anslutet till stamfader proliferation och differentiering är i stort sett okänd. Pankreas explantation kulturer är ett idealiskt system för att belysa dessa processer ex vivo 5,9,11. Genom att kombinera levande cell imaging med…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forskning inom den Spagnoli labbet. finansieras av Helmholtz Association, FP7-IRG-2008-ENDOPANC bidrag och ERC-2009-Starta HEPATOPANCREATIC Grant.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Antibodies:
Carboxypeptidase
E-cadherin
F-actin
Glucagon
Insulin
β1-integrin
Pdx1
Pdx1
Phospho-Histone H3
AbD Serotec
Invitrogen
Molecular Probes
ImmunoStar
Millipore
Millipore
Abcam
Hybridoma bank
Cell Signalling
1810-0006
13-1900
A-12373
20076
4011-01
MAB1997
ab47267
F109-D12
9706
 
Basal Medium Eagle (BME) Sigma B1522-500ML Kept in sterile conditions
Cell culture grade water PAA S15-012 Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm MatTek Corporation P35G-0-20-C  
Donkey Serum Chemicon S30-100 ml  
Fetal calf serum Gold PAA A15-151 Kept in sterile conditions
Fibronectin Invitrogen 330100-8 Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin Invitrogen 15750-037 Kept in sterile conditions
Glutamine Invitrogen 25030-024 Kept in sterile conditions
4-well Multidishes Nunc 176740  
Microscopes:
Inverted Confocal Microscope (LSM 700)
Stereomicroscope (Discovery V12)
Zeiss

Zeiss
  Objectives:
C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm)

Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde Roth 0335.3 Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm VWR HECH567/1  
Penicillin/Streptomycin PAA P11-010 Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm Greiner Bio-One 628102  
Petri dishes, 35 mm Greiner Bio-One 627161  
1X PBS, pH7.4 PAA H15-002 Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved Fine Science Tools 15023-10  
Triton-X100 Roth 3051.3  
Watchmaker’s foreceps Dumont #5 Roth K342.1  

References

  1. Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
  2. Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
  3. Puri, S., Hebrok, M. Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development. Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).
  4. Spagnoli, F. M. From endoderm to pancreas: a multistep journey. Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).
  5. Hick, A. -. C. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).
  6. Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137, 4295-4305 (2010).
  7. Kesavan, G. Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification. Cell. 139, 791-801 (2009).
  8. Zhou, Q. A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis. Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).
  9. Percival, A., Slack, J. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).
  10. Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).
  11. Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
  12. Magenheim, J. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
  13. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).
  14. Horb, L. D., Slack, J. M. Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas. Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).
  15. Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).

Play Video

Cite This Article
Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979, doi:10.3791/3979 (2012).

View Video