Qui, si descrive un metodo per l'isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un ottimo<em> Ex vivo</emSistema> per studiare vari aspetti dello sviluppo del pancreas, tra cui la morfogenesi, la differenziazione e la crescita. Espianti gemma del pancreas possono essere coltivate per diversi giorni e utilizzato in una vasta gamma di applicazioni diverse, tra cui tutto il supporto di immunofluorescenza e di imaging dal vivo.
Il pancreas controlla le funzioni vitali del nostro corpo, compresa la produzione di enzimi digestivi e la regolazione dei livelli di zucchero nel sangue 1. Anche se negli ultimi dieci anni molti studi hanno contribuito a una solida base per la comprensione organogenesi del pancreas, persistono importanti lacune nella nostra conoscenza della formazione pancreas primi 2. Una comprensione completa di questi primi eventi si permettono di percepire lo sviluppo di questo organo, ma anche in materia di malattie incurabili che colpiscono il pancreas, come il diabete o il cancro del pancreas. Infine, questa informazione genererà un progetto per sviluppare terapie di sostituzione cellulare nel contesto del diabete.
Durante l'embriogenesi, il pancreas proviene da diverse escrescenze embrionali del endoderma foregut dorsale e ventrale al giorno embrionale (E) 9.5 in embrione di topo 3,4. Entrambi escrescenze evaginate nel mesenchima circostante come solido epiteligemme l, che subiscono la proliferazione, la differenziazione e la ramificazione di generare un organo pienamente maturo 2,5,6. Evidenze recenti hanno suggerito che la crescita e la differenziazione delle linee cellulari pancreatiche, comprese le producono insulina β-cellule, dipende dalla corretta tessuto-architettura, rimodellamento epiteliale e il posizionamento all'interno delle cellule dell'epitelio del pancreas ramificazione 7,8. Tuttavia, come ramificazione morfogenesi si verifica ed è coordinata con la proliferazione e la differenziazione nel pancreas è in gran parte sconosciuto. Questo è in parte dovuto al fatto che le attuali conoscenze circa questi processi di sviluppo è basata quasi esclusivamente su analisi di campioni fissati, mentre gli eventi morfogenetici sono altamente dinamici.
Qui, si riporta un metodo per la dissezione e mouse coltura embrionale pancreatico gemme ex vivo su piatti fondo di vetro, che consentono la visualizzazione diretta del pancreas sviluppo (Figura 1). Questo cultoure sistema è idealmente concepito per microscopia confocale a scansione laser e, in particolare, live-cell imaging. Espianti pancreatiche può essere preparato non solo dal tipo selvatico embrioni di topo, ma anche da ceppi di topi geneticamente modificati (transgenici o knockout per esempio), che consente studi in tempo reale di fenotipi mutanti. Inoltre, questo sistema di coltura ex vivo è utile per studiare gli effetti dei composti chimici di sviluppo pancreatico, consentendo di ottenere dati quantitativi circa proliferazione e crescita, allungamento, ramificazione, tubulogenesis e differenziazione. In conclusione, lo sviluppo di un metodo ex pancreas cultura in vivo espianto combinato con imaging ad alta risoluzione fornisce una solida piattaforma per l'osservazione di eventi morfogenetici e la differenziazione che si verificano all'interno del embrione di topo in via di sviluppo.
Una volta che il destino del pancreas viene specificato, le cellule progenitrici del pancreas sottoposti proliferazione diffusa, differenziazione e morfogenesi per formare alla fine un organo maturo e funzionale 2,4. Attualmente, come ramificazione avviene nel pancreas e come è collegata alla proliferazione e differenziazione progenitore è ampiamente sconosciuta. Culture espianto pancreatici rappresentano un sistema ideale per chiarire questi processi ex vivo 5,9,11. Grazie alla combinaz…
The authors have nothing to disclose.
Ricerca in il laboratorio Spagnoli. è finanziato dalla Associazione Helmholtz, FP7-IRG-2008-ENDOPANC concessione e ERC-2009-Starting Grant HEPATOPANCREATIC.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
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Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
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Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
Watchmaker’s foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |