Et system til<em> Ex vivo</em> Dyrkning af embryonale Pancreas

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering, kultur og manipulation af muse embryonale pancreas. Dette repræsenterer en fremragende<em> Ex vivo</em> System for at studere forskellige aspekter af bugspytkirtlen udvikling, herunder morfogenese, differentiering og vækst. Pancreas opløbet eksplantater kan dyrkes i flere dage og anvendes i en række forskellige applikationer, herunder hele-mount immunofluorescens og direkte billedvisning.

Abstract

Bugspytkirtlen styrer vitale funktioner i vores krop, herunder produktion af fordøjelsesenzymer og regulering af blodsukkeret ^1. Selv om der i det seneste årti mange undersøgelser har bidraget til et solidt grundlag for at forstå bugspytkirtlen organogenese, vigtige huller stadig i vores viden om tidlig pancreas formation ^2. En fuldstændig forståelse af disse tidlige hændelser vil give indsigt i udviklingen af ​​dette organ, men også ind i uhelbredelige sygdomme, der er målrettet bugspytkirtlen, såsom diabetes eller kræft i bugspytkirtlen. Endelig vil denne information generere en plan for udvikling af celle-udskiftning behandlingsformer i forbindelse med diabetes.

Under embryogenese, stammer bugspytkirtlen fra forskellige embryoniske udvækster på den dorsale og ventrale foregut endoderm på fosterdag (E) 9.5 i museembryo ^3,4. Begge udvækster evaginate i det omgivende mesenkym som faststof epitell knopper, som undergår proliferation, forgrening og differentiering til at generere en fuldt moden orgel ^2,5,6. Nylige beviser tyder på, at væksten og differentieringen af pankreatiske cellelinier, herunder de insulinproducerende β-celler, afhænger af korrekt vævs-arkitektur, epithelial remodellering og celle-placering i det forgrenings pancreas epitel ^7,8. Men hvor forgrening morfogenese forekommer, og er koordineret med proliferation og differentiering i pancreas er stort set ukendt. Dette er til dels skyldes, at den nuværende viden om disse udviklingsprocesser har næsten udelukkende på en analyse af faste prøver, mens morfogenetiske begivenheder er meget dynamisk.

Her rapporterer vi en fremgangsmåde til at dissekere og dyrkning af muse embryonale pancreatisk buds ex vivo på glas bunden retter, som giver mulighed for direkte visualisering af det udviklende pancreas (figur 1). Denne kulture system er ideelt udtænkt til konfokal laserscanningsmikroskopi og især, live-cell imaging. Pancreas eksplantater kan fremstilles ikke blot af vildtype-museembryoer, men også fra gensplejsede musestammer (fx transgene eller knockout), hvilket muliggør tidstro studier af mutante fænotyper. Desuden er denne ex vivo-dyrkningssystemet er værdifuldt at undersøge effekten af kemiske forbindelser på pancreasudviklingen, gør det muligt at opnå kvantitative data om proliferation og vækst, forlængelse, forgrening, tubulogenesis og differentiering. Som konklusion, giver udviklingen af en ex vivo bugspytkirtlen eksplantat kultur metode kombineret med høj opløsning billeddannelse en stærk platform til at observere morfogenetiske og differentiering hændelser som de forekommer inden for udvikling museembryo.

Protocol

Protokollen beskrevet her, er blevet tilpasset fra den teknik, der oprindeligt blev beskrevet i Percival og Slack 9 og optimeret til konfokal mikroskopi. 1. Overfladebehandling af Glass Bottom dyrkningsskåle De følgende trin bør udføres under sterile betingelser i et laminært stinkskab. Pancreas eksplantater dyrkes i 35 mm petriskåle med 20 mm diameter glass mikrobrønd bund (f.eks Mattek Corporation). Brug en glas bund fad pe…

Discussion

Når bugspytkirtlen skæbne er angivet, pancreasstamfaderceller gennemgår omfattende proliferation, differentiering og morfogenese til sidst danne en moden og funktionel orgel ^2,4. I øjeblikket finder hvordan forgrening sted i pancreas, og hvordan den er tilsluttet progenitor proliferation og differentiering er stort set ukendt. Pancreas eksplantatkulturer udgør et ideelt system til at belyse disse processer ex vivo ^5,9,11. Ved at kombinere live-cell imaging med ex vivo eksplan…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1