Un système d'<em> Ex vivo</emLa culture> de pancréas embryonnaire

Summary

Ici, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la manipulation du pancréas embryonnaire de la souris. Cela représente une excellente<em> Ex vivo</em> Système pour l'étude des divers aspects du développement du pancréas, y compris la morphogenèse, la différenciation et la croissance. Explants de bourgeons pancréatiques peuvent être cultivées pendant plusieurs jours et utilisé dans une variété d'applications différentes, y compris l'ensemble de montage immunofluorescence et imagerie en temps réel.

Abstract

Le pancréas contrôle les fonctions vitales de notre corps, y compris la production d'enzymes digestives et la régulation de la glycémie ^1. Bien que dans la dernière décennie de nombreuses études ont contribué à une base solide pour la compréhension de l'organogenèse du pancréas, des lacunes importantes subsistent dans notre connaissance de la formation du pancréas au début ^2. Une compréhension complète de ces événements précoces donnent un aperçu de l'évolution de cet organe, mais aussi sur les maladies incurables qui ciblent le pancréas, comme le diabète ou le cancer du pancréas. Enfin, cette information sera générer un modèle pour l'élaboration de cellules en remplacement des traitements dans le cadre du diabète.

Au cours de l'embryogenèse, le pancréas provient de différentes excroissances embryonnaires de l'endoderme intestin antérieur dorsal et ventral à jour embryonnaire (E) 9,5 ^3,4 chez l'embryon de souris. Les deux excroissances evaginate dans le mésenchyme environnant solide épithéliumbourgeons l, qui subissent la prolifération, la différenciation et de branchement pour générer un organe pleinement matures ^2,5,6. Des preuves récentes ont suggéré que la croissance et la différenciation des lignées de cellules pancréatiques, y compris les productrices d'insuline des cellules β, dépend de la bonne tissulaire architecture, remodelage épithélial et le positionnement cellulaire dans l'épithélium pancréatique de branchement ^7,8. Cependant, comment morphogenèse de ramification se produit et est coordonné avec la prolifération et la différenciation dans le pancréas est largement inconnue. Ceci est en partie dû au fait que les connaissances actuelles sur ces processus de développement reposait presque exclusivement sur l'analyse des échantillons fixés, alors que les événements morphogénétiques sont très dynamiques.

Ici, nous présentons une méthode pour disséquer et de la souris en culture du pancréas embryonnaire ex vivo sur des bourgeons plats à fond de verre, ce qui permet la visualisation directe du pancréas en développement (figure 1). Ce culteure système est idéalement conçu pour la microscopie confocale à balayage laser et, en particulier, imagerie des cellules vivantes. Explants pancréatiques peuvent être préparés non seulement à partir d'embryons de souris de type sauvage, mais aussi à partir de souches de souris génétiquement modifiées (transgéniques ou knock-out par exemple), ce qui permet en temps réel des études de phénotypes mutants. En outre, ce système culture ex vivo est précieux pour étudier les effets des composés chimiques sur le développement du pancréas, ce qui permet d'obtenir des données quantitatives sur la prolifération et la croissance, l'allongement, la ramification, tubulogenèse et la différenciation. En conclusion, le développement d'une méthode in vivo du pancréas culture ex explant combiné avec l'imagerie haute résolution fournit une base solide pour l'observation d'événements morphogénétiques et de différenciation tels qu'ils se présentent dans l'embryon de souris en développement.

Protocol

Le protocole décrit ici a été adapté à la technique décrite à l'origine de Percival et Slack 9 et optimisé pour la microscopie confocale. 1. Revêtement de plats Glass Bottom Culture Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Explants pancréatiques sont cultivées dans des boîtes de Pétri de 35 mm à 20 mm de diamètre en verre micropuits bas (par exemple…

Discussion

Une fois le sort du pancréas est spécifié, les cellules progénitrices pancréatiques subissent une prolifération extensive, la différenciation et la morphogenèse, à terme, constituer un organe mature et fonctionnelle ^2,4. À l'heure actuelle, comment les branches se déroule dans le pancréas et la façon dont elle est reliée à la prolifération et la différenciation des progéniteurs est largement inconnue. Des cultures d'explants pancréatiques représentent un système idéal pour éluci…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1