Summary
我々はすぐに識別し、マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を特徴付けるための蛍光レポーターアッセイを説明します。
Abstract
多能性と自己複製は、胚性幹細胞（ES細胞）の2つの定義特性です。基本的な分子機構を理解することは非常に発生生物学研究、疾患モデル、創薬、再生医療（1,2日で）のES細胞の使用を容易にします。
ES細胞の維持と自己複製の新たな調節因子の同定と特徴付けを促進するために、我々は定量的にOct4GiPセル3を用いたマウスES細胞における自己複製の状態を測定する蛍光レポーターベースのアッセイを開発しました。 Oct4GiP細胞は4,5 Oct4の遺伝子のプロモーター領域の制御下にある緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する。 Oct4のは、ES細胞の自己複製に必要とされており、非常にES細胞で発現し、急速に分化6,7の間にダウンレギュレートされています。その結果、レポーター細胞におけるGFPの発現と蛍光が忠実に相関ES細胞のアイデンティティー5と、蛍光活性化セルソーティング（FACS）で分析が密接に単一細胞レベル3,8の細胞の自己複製状態を監視するために使用することができます。
RNAiのと相まって、Oct4GiPレポーターアッセイは、すぐにES細胞の維持と自己複製3,8のレギュレータを識別し、研究するために使用することができます。自己複製を分析するための他の方法に比べ、それ以上の、便利な高感度、定量的、かつ低コストである。それは、96に実施することができる - または、ハイスループットスクリーニングや遺伝子のエピスタシス解析などの大規模研究のための384ウェルプレート。最後に、他の系統特異的レポーターES細胞株を使用することによって、我々はここで説明するアッセイはまた、ES細胞の分化の間に運命の仕様を勉強するように変更することができます。
Protocol
1。 Oct4GiPマウスES細胞の維持
Oct4GiP細胞は、親切に博士はオースティンスミスによって提供されました。彼らは、Oct4の-GFPiresPacトランス4,5を運ぶ129/Olaマウスから得られた。彼らはESGRO完全プラスクローングレード培地（ミリポア社製）、またはM15培地でゼラチンコート組織培養プレートに保持されます：DMEM（Invitrogen社）は、15％FBS、1000 U / mlのESGRO（ミリポア社製）、1Xを添加した非必須アミノ酸（Invitrogen社製）、1X EmbryoMax Nucleasides（ミリポア社製）、および10μMβ-メルカプトエタノール。
- 30分間室温で0.1％ゼラチン（シグマ）（0.1ミリリットルゼラチン溶液/ cm 2）を持つコートプレート。
- 〜2で、ゼラチンコートしたプレートのプレートOct4GiPセル×10 4 / cm 2である 。
- 0.05％トリプシンですべての二日間のセルを分割します。
2。 Oct4GiP細胞におけるsiRNAトランスフェクション
Oct4GiPレポーターアッセイは、最もconvenienです。M15培地中でまたは384ウェルプレート（CorningまたはBD） - TLYゼラチンでコーティングされた平坦な底部96に実施した。全体的な手順は、 図1に概説されています。
- siRNAを脂質複合体のアセンブリ：
- 96ウェルプレートでトランスフェクションのために、U底96ウェルプレートでのsiRNA-脂質複合体を組み立てる。
- 各ウェルに、10μlののOptiMEM（Invitrogen社製）、0.3μlのリポフェクトアミン2000（Invitrogen）を混合し、室温で5分間インキュベートします。
- 脂質のOptiMEM混合物に5 pmolのsiRNAを追加し、さらに15分間インキュベートします。 siRNAは：6ul：脂質比は100 pmolのです。
- マルチチャンネルピペットを用いてゼラチンでコーティングされた平底プレートにU-底板からのOptiMEM中のsiRNA-脂質複合体を転送します。
- 384ウェルプレートでトランスフェクションのために、0.1μlのリポフェクタミン2000および10μlのOptiMEM 2 pmolのsiRNAを用いたsiRNA-脂質複合体を準備します。
注：最終siRNA濃度でトランスフェクションは50nmである。 3月4日の生物学を行うそれぞれのsiRNAトランスフェクションのために複製されます。平底ゼラチンコートプレートにU-底板とアリコート中のsiRNA-脂質複合体のマスター混合物を設定します。
- Oct4GiP細胞播種とトランスフェクション：
- 96ウェルプレートでトランスフェクションのために、Oct4GiP細胞を収集し、9×10 4細胞/ mlに、新鮮なM15培地に再懸濁します。
- よくマルチチャンネルピペットを用いて各細胞懸濁液100μlを添加します。
- 上下に3-5回のピペッティングでよくで事前に分注したsiRNA-脂質複合体と細胞懸濁液を混ぜる。異なるsiRNAのトランスフェクションするためのヒントを変更します。
- 384ウェルプレート、再懸濁しOct4GiPセル〜6×10 4細胞/ ml、アリコート30μlの細胞懸濁液中のトランスフェクションのために各ウェルに。
注：最適な細胞播種密度は通常3×10 5細胞/ cm 2であるが、メートルAYは劇的に細胞の増殖または生存に影響を及ぼすsiRNAをさらに最適化する必要があります。低播種密度は、トランスフェクション時に悪い細胞の生存につながる。高いメッキ密度が高い細胞合流分化誘導による高いバックグラウンドの原因になります。 2から4×10 5細胞/ cm 2の間に必要に応じて、テストの播種密度。
- メディア変更：
- マルチチャンネルアスピレーター（コーニング）または真空ワンド（VP-Scientific）を使用して、古い培地を除去します。プレートの下部にある細胞を傷つけないように注意してください。
- 毎日のマルチチャンネルピペットを用いて新鮮なES細胞用培地（96ウェルプレートに100μlと384ウェルプレートで30μl）を持つ細胞を供給します。
3。 FACS分析
- 細胞解離：
- 四日間トランスフェクション後、マルチチャンネルアスピレーター（コーニング）または真空ワンド（VP-Scientific）を用いて培地を除去します。
- 96ウェルプレートの場合は、100μで一度細胞をリンスリットルPBS。
- よくマルチチャンネルピペットを用いて、それぞれに25μlの0.25％トリプシンを追加します。
- 時折撹拌しながら5分間室温でインキュベートし、視覚的に細胞の完全な分離を確保するために点検してください。
- トリプシンを不活性化し、繰り返しピペッティングによって単一細胞懸濁液に細胞を解離するために10％FBSを含むPBS90μlのを追加します。
- 384ウェルプレートの場合は、10％FBS、30μlのPBSと10μlのトリプシンとクエンチで細胞を解除します。
- FACS分析：
- HTS装置または他の似たようなFACSアナライザ（例えばAccuriまたはIntellicytなど）を搭載したBD LSRII FACSアナライザのGFP蛍光を分析する。
- HTSの高スループットモードを使用し、細胞懸濁液10μlを分析します。 1.0×10 4細胞にカウントしきい値を設定します。
- 前方に対側の散布図の細胞をキャプチャするためにPMT電圧としきい値を調整します。 FORWのライブ細胞集団にゲートARD対側の散布図。
- GFPチャネルのヒストグラムプロットを作成します。細胞の約10％は、モックまたはコントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞ではGFP陰性であることが表示されるように、GFPチャネルのゲートを設定します。
- ％分化した細胞=％GFP陰性細胞：各治療から％GFP陰性細胞を決定します。 2両側t検定を用いた実験およびコントロールsiRNAをトランスフェクションの間に％分化した細胞を比較し、p値<0.01と正のヒットを獲得。
4。代表的な結果
OCT4、Nanogの、とSox2はES細胞の自己複製6,7,9-11の維持に重要な役割を果たして3遺伝子である。 図2は、Oct4GiPレポーターアッセイが容易にこれらの要因をサイレンシングによって引き起こされる分化を検出することができますOct4GiP ES細胞。
図2Aは、ESとして維持するときOct4GiP ES細胞がGFP陽性であることを示して 図2Bの細胞が前方に対側の散布図と制御またはOct4の-siRNAでトランスフェOct4GiP細胞のGFPチャネルのヒストグラムを示しています。死んだ細胞や破片はGFP陰性であり、バックグラウンドを増加させるとして、前方対側の散布図でのライブセルのゲートに必要である。一方、可能な細胞塊を除外するために二重の差別は常に必要ではありません。コントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞において、細胞の大半はGFP陽性でなければなりません。明らかにGFP陰性集団はコントロールsiRNAをトランスフェクトしたウェル中に存在する場合、開始Oct4GiP細胞やトランスフェクション手順が損なわれている可能性があり、その結果が解釈されない場合があります。
図2Cは、コントロール、Oct4の - 、Nanogの、、とSox2-siRNAをトランスフェクトした細胞から分化した細胞％（％分化した細胞=％GFP陰性細胞）のバーグラフを示しています。
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図1。 Oct4GiPレポーターアッセイの概要 。
図2。 Oct4GiPレポーターアッセイは、Nanog、Oct4のか、Sox2のサイレンシングによって引き起こされるES細胞の分化を検出することができます。 A）E14Tg2a（野生型、黒線）とOct4GiP（グリーンライン）細胞をFACSで解析した。 GFP-チャンネルのヒストグラムはOct4GiP細胞がGFP陽性であることを示している。B）Oct4GiP細胞はトランスフェクション4日後に分析し、コントロールまたはOct4の-siRNAとFACSで96ウェルプレートでトランスフェクトした。側方散乱プロットとトランスフェクトした細胞のGFP-チャンネルのヒストグラムが示されている前方に対。C）Oct4GiP細胞が制御- 、Nanogの- 、Oct4の-、または-Sox2のsiRNAでトランスフェクトした。 ％分化細胞は4日間トランスフェクション後の％のGFP陰性細胞から決定され、+ /意味としてプロットした - 平均の標準誤差（N = 4）。F = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg"ターゲット= "_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は上記の記述Oct4GiPレポーターアッセイは、定量的に自己再生対分化の程度を測定することができます。そのような形態をベース12と増殖/生存性アッセイなど他の利用可能な方法に比べ、より高い感度とスループットだけでなく、ES細胞の状態のより直接的な測定を提供しています。したがって、大規模な画面や遺伝的エピスタシス解析のために適している。実際、我々と他の成功したゲノムワイドなRNAiスクリーニングのために3,8 Oct4GiPレポーターアッセイを使用しています。全てのアッセイと同様に、しかし、それはまた、制限があります。それは、直接または間接的にOct4のプロモーター活性を調節する遺伝子を研究するために、それが誤って、転写後にGFPの発現、安定性や機能に影響を与える遺伝子を識別することができる使用することができます。したがって、追加のアッセイあるいはアルカリホスファターゼ染色13（ミリポア、SCR004）と免疫蛍光染色または定量RTなどの二次の画面、多能性マーカーの-PCRは、3,8,12,14、この方法から得られた結果を確認する必要があります。
Oct4GiPレポーターアッセイは、効率的な遺伝子サイレンシングに依存しています。効果的なsiRNAで効率的なsiRNAのトランスフェクションアッセイの成功への鍵です。我々は唯一のsiRNAトランスフェクションとレポーターアッセイの使用を説明したが、このアッセイはまた、沈黙や、興味のある過剰発現する遺伝子にDNAトランスフェクションを行うことができる。 DNAトランスフェクション効率は、siRNAのそれよりも通常少し低くなりますと表現型の強さを減らすことができます。
このプロトコルで記述されているだけでなく、Oct4GiPレポーターアッセイに悪影響を同様に自己複製を制御する遺伝子を同定し、特徴付けるために変更することができます。その場合には、細胞のsiRNAをトランスフェクトすることができ、分化条件で培養した。自己再生の負の調節因子のサイレンシングは、自己再生を強化し、dをすることができますGFP発現を維持するでしょうと同様に、現在のプロトコルで説明されてFACSによってetected。
Oct4GiPレポーター細胞に加えて、そのような多能-GFP 15-18（ミリポア、SCR089）とRex1-GFP 19細胞としてES細胞特異的プロモーターを使用して、他のレポーター細胞株は、また生成されました。彼らはまた、ES細胞の自己複製と同じ戦略を使用してメンテナンスを研究するために使用することができます。これらのES細胞マーカー遺伝子のプロモーターの活性と特異性に顕著な違いがあるため、しかし、これらのレポーター細胞株は、バックグラウンドレベルと感度の点で動作が異なるため、お互いを補完します。最後に、他の系統特異的レポーターES細胞株を使用することによって、我々の戦略は、ES細胞の運命仕様を検討し、哺乳類の早期開発のためのin vitroモデルとしてES細胞の使用を容易にするために変更することができます。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、原稿を読んで、編集するためのブラッドLackfordに感謝します。この研究は国立環境健康科学研究所、保健学内研究プログラム国立研究所Z01ES102745（GHまで）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
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