En snabbare, högupplöst, MTPA-GFP-baserade Mitokondriell Fusion analys förvärva Kinetiska Uppgifter om flera celler parallellt med användning av konfokalmikroskopi

Summary

Mitokondriell fusion mättes genom att spåra utjämning av photoconverted matrix målinriktat GFP över mitokondriella nätverket över tid. Så här långt, kan endast en cell skall utsättas för en timmes kinetisk analys vid en tidpunkt. Vi presenterar en metod som samtidigt mäter flera celler, vilket snabbar upp insamlingen av uppgifter.

Protocol

1. Bild Plate Preparation

1. Kultur INS1 celler i RPMI medium innehållande 10% standard fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin, 50 | iM 2-merkaptoetanol, 5 mM NaHCOs _3, 2 mM HEPES, 2 mM pyrodruvsyra och 11 mM glukos till 80% konfluens.
2. Trypsinisera de INS1 cellkulturer med 0,05% trypsin och plattan dem på poly-D-lysin-belagda täckglas-bottnade avbildande plattor (30-40% konfluens).
3. Låt för plåtar för att nå 60-80% konfluens (~ 2 dagar) och tillsätt mitokondriens matrix riktade (COXVIII) adenovirala PA-GFP under 24 timmar (MOI = 5). Växlingsmediet och tillåter celler att växa under ytterligare 2 dagar före avbildning.
4. På dagen för avbildning, tillsätt 7-15 nM TMRE till avbildande plattorna, och jämvikt under minst 45 minuter.
5. Under denna tid sväng på inkubatorn (steg övre inkubator har använts här) och låt mikroskop för att ekvilibrera till 37 ° C under ca 1 timme. Slå på _5% CO2.

   2. Imaging Parametrar för Zeiss LSM 710 konfokalmikroskop

   1. Efter mikroskopet har jämvikt, under Förvärv fliken, klicka på "Visa manuella verktyg", öppnar avbildning som panelen, och välj "kanal läge" och växla spåra varje "frame".
   2. Mot bakgrund vägen panelen, välj LSM och kanal-läge. Arbeta från provet ikonen uppåt, välj "bakre", MBS 690 + och MBS 488. Vid botten av panelen genom att välja "T-PMT" för att möjliggöra visualisering av den ljusa fält eller DIC kanal.
   3. Avsluta om justering av ljusvägen parametrar genom att ställa in området för GFP färgämnet till 490-540 nm och att 580-700 nm för färgämnet TMRE.
   4. I förvärvet läget använder en 512 × 512 fältet bildelementavsökning, genomsnittliga 4x och välja en zoomfaktor (som du kanske vill behålla konsekvent för kalibrering).

   3. Optimera Imaging Parametrar

   1. Använda planen apochromat 100x (1,4 NA) objektiv, FOCoss på dina celler med halogen ljus, inte fluorescerande ljus, för att skydda mitokondrier från fototoxicitet.
   2. Screen för PA-GFP-uttryckande celler med användning av maximalt öppen por och skanning för att hitta de celler som är ljusare grön.
   3. Hitta lägsta effekten av 2-fotonen laser behövs för att aktivera PA-GFP och optimera avbildning parametrarna ser till att signalen inte mätta detektorn. Kontrollera att PA-GFP-signal colocalizes med TMRE signalen för några z-serien. Förlust av TMRE indikerar mitokondrie depolarisering eller fototoxicitet, och celler uppvisar dessa egenskaper bör inte användas för analys.
   4. Hitta en PA-GFP-uttryckande celler och ange en zoomfaktor.
   5. Ställ z-serie att samla 6 skivor (detta område kommer att behöva tillfredsställa alla 10 celler om inte en specifik z-fokus är inställt vid varje position).
   6. Spara det bildgivande förfarande för varje cell (cell 1, cell 2 mm).

   4. Justera Automated del av programmet och utse de 10 celler som du kommer att följa för 1 timme Mitochondrial Fusion analys

   1. På den vänstra panelen i multitime fönstret, välj "spara" panel, och ange platsen där filerna ska sparas.
   2. I "Acquisition" panel, ladda förvärvsmetoden sparas för cell 1 i scan-konfiguration och kontrollera z stacken rutan. Även välja "markerad Z-mitten av Z stack".
   3. I "block" väljer du "single-block på varje plats". Klicka på "Lägg block" för varje intervall som skall mätas.
   4. I "timing" väljer du "vänta-intervall" och skriv "0" i "vänta intervall före block på första plats bara". Block 2-4 kommer att ha "15 min" i detta avsnitt.
   5. På den plats på panelen, välj "flytta fokus för att ladda läge mellan orter" och "last igenom config när" flyttar till LOC "eller" nästa loc "klickade. Under" redigera platserna lista "välj" rensa alla "och välj sedan" flera platser motoriserade stadiet ".
   6. UndER på "Bleach" panel, klicka på "lut" rutan, och ange konfigurationsfilen i "config" rullgardinsmenyn, som utsetts i fönstret av de viktigaste programvaran. Sedan i "blekning" fönstret, spara lämplig fotoaktivering metoden. I regionerna panelen, välj ROI för just denna cell och lägga till ROI på multitime genom att välja "Lägg till aktuell region till ROI lista"-fönstret. Var noga med att välja samma plats i "ROI" rullgardinsmenyn.

   För att tidtagningen ska fungera korrekt och för varje cell har en 15 minuters intervall, två metoder måste sparas. I listan av block, kommer den första har "riktiga" fotoaktivering konfiguration och resten kommer att ha en "mock" konfiguration som inte använder två-photon laser. Det första blocket kommer också att vara den enda block som inte har en fördröjning (BKIntv = 0). Därför börjar metoden med en baslinje avsökning, följs av en fotoaktivering avsökning. Resten av blocken har en 900 sek BkIntv, ochvid varje tidpunkt finns det två avsökningar lika vid tiden 0 sek, för att bibehålla timingen konsistens.

   7. För var och en av de 10 celler som skall följas över tiden, utför denna sekvens:
      Hitta en PAGFP uttrycker cell-rädda sin avbildningsmetod
      Plats panel-markera scenen positionen anger avbildningsmetod
      Huvud ROI panel-välj en region av intresse att fotoaktiverade Bleach panel-sparar specifika ROI och även ladda den i ROI rutan:
      Radera ROI och återställa skanningen zooma till 1
      Hitta nästa cell och ställ in zoom
      Upprepa processen för de kommande 9 celler

   Kontrollera att varje steg plats och alla block ha lämplig avbildningsmetod (scan konfiguration) förknippas med. Se också till att det första blocket på varje plats motsvarar det fotoaktivering metoden medan resten innehåller en "mock"-metoden. Slutligen, välj "kör".

   5. Analysera PA-GFP signalstyrkan

   1. Därefter exportera data till Excel och beräkna den genomsnittliga intensiteten för z-stackar vid varje tidpunkt. Släng optiska delar som inte har någon signal.
   2. Mäta signalen spädning i varje z-stapel genom att beräkna den procentuella andelen av den ursprungliga fotoaktiverade signalen.

   Varje datapunkt scannas och registreras två gånger, vilket resulterar i duplikat z-stacken för varje tidpunkt. Kontrollera att z-stack värden överens. Om inte, vilket indikerar ett problem (t.ex. fokus, cellrörelse).

   6. Representativa resultat

   När en fusion händelse inträffar mellan en aktiverad och ej aktiverad PA-GFP mitokondrien, blandar PAGFP inom den mitokondriella matrisen med icke-märkt matris och blir späddes över en större yta, vilket minskar signalintensitet (Figur 1A). I INS1 cellen sker en signifikant minskning i signalintensitet var 15 minuter, tills jämvikt av mitokondriell fusion har uppnåtts (ca 1 timme). Notera att cellen i figur 1B uppvisar nästan fullständig samlokalisering av PA-GFP och TMRE signaler. Vid dessa analyser en mycket låg koncentration av TMRE (15 nM) användes för att hjälpa rikta fotoaktivering av PAGFP, och även för att övervaka cell hälsa. Celler med ett överflöd av depolariserad mitokondrier har ofullständiga samlokalisering av PAGFP och TMRE och bör inte analyseras eftersom denna indikerar antingen fototoxicitet, eller celler i en döende tillstånd.

   Jämviktstiden för mitokondriell fusion är vanligen 1 h i INS1 celler, när ~ 15% av den mitokondriella volym aktiveras. Ibland, även om en liten yta belyses, de flesta av mitokondrier blivit fotoaktiveras grund att vara mycket nätverk, i vilket fall ytterligare fusion är svårt att upptäcka. Andra celltyper kan uppvisa olika ekvilibreringstider och bör provas vid kortare intervaller och över en längre period för att karakterisera mitokondriella dynamik. Att inhibera mitokondriell sammansmältning kan cellerna placeras i en lipotoxic miljö. Det har tidigare visats att 0,4 mM palmitat fragment mitokondrier, och inhiberar mitokondriell sammansmältning ^9. Denna effekt kan ses i figur 2, där mitokondrier fragmenteras, men signalstyrkan i mtPAGFP inte förändras så mycket som under normala förhållanden (figur 1). Därför är utspädning av PA-GFP-signal sannolikt bero på mitokondrie-fusion snarare än fission. I andra celltyper föreslår vi att du använder andra kända sätt att inducera mitokondrie fragmentering, såsom tysta OPA1 som är nödvändig för mitokondriell fusion ^14.

   
   Figur 1. A. PA-GFP blir successivt dimmer på grund av mitokondriella fusion händelser som leder till utspädning av proteinet över ett allt större område som kan ses i dessa projicerade bilder 6 optiska sektioner kvantifieras var 15 minuter. B. TMRE med PA-GFP visar att mitokondrierna är aktiva och inte depolariseras. Klicka här för att visa en större bild .

   
   Figur 2. Mitokondriell fusion hämmade med 0,4 mM palmitat minskar utspädningen av PA-GFP. A. Prognoser för 6 optiska sektioner som visar korta mitokondrier med en oföränderlig signalstyrka över tiden. B. samlokalisering av PA-GFP med TMRE visar att mitokondrierna inte depolariserad. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Denna metod gör det möjligt att avbilda cirka 10 celler vid en tid, om förvärvet sker var 15: e minuter efter fotoaktivering. Det exakta antalet celler kommer att bero på hur snabbt man kan lokalisera och markera mtPAGFP uttrycker cellerna i kulturen skålen och hur snabbt man kan ställa in alla program parametrar. För att göra automation smidigt ett jämnt lager av celler bör användas eftersom de angivna z-stack marginaler kommer att gälla för alla celler.

Storleken på denna inledande fotoaktivering området kommer att styra jämvikt tiden. För att kunna mäta mitokondrie fusion, är det viktigt att photoactivate endast 10-20% av nätet, så att spridningen av signal till resten av nätverket kan följas över tid. Om alltför mycket av nätet fotoaktiveras, är det möjligt att en fullständig fusion kommer att ske för snabbt, och händelsen kommer inte att fångas.

Extrem försiktighet måste vidtas för attjustera lasereffekten i två-foton-laser samt TMRE koncentration för att undvika fototoxicitet som leder till mitokondriellt depolarisation. Säkerställa att mtPAGFP signalen colocalizes med TMRE signalen kan hjälpa till att bedöma fototoxicitet och allmänna cell hälsa ^8,15. Belysning med ljus epifluoerescent bör undvikas. Samtidigt söka efter celler som uttrycker mtPAGFP bör pinhole vara maximalt öppen när du skannar med låg effekt 488 nm excitation. Justering av två-foton-lasereffekten att photoactivate tillräckligt PA-GFP för att mäta signalen över 1 timme, men inte till oversaturate någon av cellerna kan vara svårt ^8. Bör dock tiden spenderas i denna optimering steg eftersom när automatiserat program startas, är det jobbigt att stoppa det, att välja fler celler och återuppta.

För kvalitetskontroll, förvärv av en differential interferens kontrast (DIC) bild (eller överföras ljus) för att övervaka fokus på cellerna kan vara myckethjälpsamma och också ett bra sätt att upptäcka bubblor som bildas i immersionsolja vid skanning, vilket händer ibland från rörelser på scenen.

Även med denna mtPAGFP metod samlar uppgifter om enkelriktade flödet av mitokondriens matrix proteiner från fotoaktiveras mitokondrier till dem som inte är märkta, är det tänkbart att utnyttja denna teknik för att studera andra processer. Till exempel kan specifika fluorokromer fästas membranproteiner för att observera deras specifika rörelser under fusionshändelser, vilket har visats för ABC-mig, fusion av vilka inträffar på en annan tidsskala från blandningen av lösliga matrisproteiner ^15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Carl Zeiss, Inc.