Visualisierung und Analyse des Blutflusses und der Sauerstoffverbrauch in hepatischen Mikrozirkulation: Anwendung auf eine akute Hepatitis-Modell

Summary

Ein optisches System wurde entwickelt, um hepatischen Mikrozirkulation mit FITC-markierten Erythrozyten visualisieren und die Sauerstoff-Partialdruck in der Mikrogefäße laserunterstützte phosphorimetry messen. Diese Methode kann verwendet werden, um physiologische und pathologische Mechanismen durch die Analyse von mikrovaskulären Struktur, Durchmesser, Blutflussgeschwindigkeit, und Sauerstoff-Partialdruck zu untersuchen.

Abstract

Es besteht eine erhebliche Diskrepanz zwischen Sauerstoffversorgung und-bedarf in der Leber, weil Leber Sauerstoffverbrauch ist relativ hoch, aber etwa 70% der Blutversorgung der Leber ist schlecht Pfortader Blut aus dem Magen-Darmtrakt und Milz ableiten Sauerstoff angereichert. Sauerstoff wird durch Hepatozyten Blut fließt von einem Terminal Zweig der Pfortader an eine zentrale Venole über Sinusoide geliefert, und das macht eine Sauerstoff-Gradienten in Leberläppchen. Der Sauerstoff-Gradienten ist eine wichtige physikalische Parameter, der die Expression von Enzymen vor und hinter der hepatischen Mikrozirkulation, aber das Fehlen von Techniken zur Messung von Sauerstoff Verbrauch in der hepatischen Mikrozirkulation verzögerte sich die Aufklärung der Mechanismen in Bezug auf Sauerstoff-Stoffwechsel in der Leber verbunden ist. Deshalb FITC-markierten Erythrozyten verwendet, um die hepatische Mikrozirkulation visualisieren und verwendet laserunterstützte phosphorimetry, um den Partialdruck von Sauerstoff in den Mikrogefäßen dort zu messen. Noncontact und kontinuierliche optische Messung kann quantifizieren Blutflussgeschwindigkeiten, Gefäßdurchmesser und Sauerstoff-Gradienten in Bezug auf den Sauerstoffverbrauch in der Leber. Bei einer akuten Hepatitis-Modell haben wir durch die Gabe von Paracetamol bei Mäusen beobachteten wir erhöhte Sauerstoff-Druck in beiden zentralen Portal und Venolen aber eine verminderte Sauerstoff-Gradienten in den Sinusoiden, was darauf hinweist, dass Hepatozyten-Nekrose im perizentralen Zone könnte den Sauerstoffdruck Hochschalten und Enzym-Expression beeinflussen in der periportalen Zone. Abschließend können unsere optischen Methoden zur Messung der hepatischen Hämodynamik und Sauerstoffverbrauch zeigen Mechanismen im Zusammenhang mit Lebererkrankungen.

Protocol

1. Beschriften Erythrozyten mit Fluoresceinisothiocyanat Isomer I (FITC)

Alle experimentellen Protokolle verwendet, wir wurden von der Animal Care Committee der Keio University School of Medicine zugelassen.

1. Anesthetize ein Donor-Mäusen, und nach Herstellung einer Celiotomie Einschnitt zurückzuziehen Vollblut aus der Vena cava inferior mit einer 1-ml-Spritze mit kleinen Menge von Heparin. Die Maus wurde sofort von Natriumpentobarbital Injektion (100 mg / kg ip) euthanasiert.
2. Waschen des Vollbluts zweimal mit PBS (pH 7,4) durch Zentrifugation für 5 min bei 400 g in einem geschwungen-Rotor.
3. Man löst 10 mg FITC in 5 ml 100 mM Na ₂ HPO ₄ und filtern mit einer Membran mit 0,22 um Poren.
4. In einem Reagenzglas zu mischen 1 ml der FITC-Lösung mit 0,15 ml 3 mM Glucose, 0,25 ml von 180 mM NaH ₂ PO ₄ und 1,5 ml 100 mM Na ₂ HPO _4. 0,2 ml der RBC Pellet, und tippen Sie auf das Rohr zum Mischen.
5. Halten Sie das Rohr für 2 Stunden bei 4 ° C und dann waschen Sie die gefärbten Erythrozyten in PBS zweimal.
6. Eine kleine Menge des RBC-Suspension auf einem Objektträger Gras und sehen, ob die RBCs gesund aussehen (dh, dass ihre Form und Größe normal sind) und dass die Fluoreszenzintensität ist ausreichend.
7. Hängen Sie das 0,1 ml Erythrozyten in 0,9 ml PBS bei pH 7,4, und halten Sie die Suspension bei 4 ° C bis Injektion.

2. Herstellung von Sauerstoff-empfindlichen Farbstoff

1. Man löst 500 mg BSA in 10 ml PBS bei pH 7,4.
2. Zugabe von 30 mg Pd (II)-meso-Tetra (4-carboxyphenyl) porphin (Pd-TCPP) an die BSA-Lösung und über Nacht gerührt.
3. (Optional) Auszug BSA-gebundenen Pd-TCPP durch Schwerkraft-Flow-Chromatographie oder eine Spin-Säule, um sie von freien Pd-TCPP zu trennen.
4. Zentrifugieren Sie die Lösung zur Entfernung ungelöster Pd-TCPP, und filtern Sie den Überstand mit einem Membranfilter mit 0,22-um-Poren. </ Li>
5. Shop 1-ml-Aliquots in Röhrchen bei -20 ° C Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.

3. Tierische Vorbereitung

1. Für mikroskopische Beobachtung der Mikrozirkulation bereiten eine Kunststoffplatte mit einem Loch von 20 mm im Durchmesser, und Band ein 30-mm-Quadrat-Quadrat Deckglas über dem Loch.
2. Anesthetize eine Maus, entfernen Sie das Fell und die Haut prep. Setzen Sie ein Katheter in den Schwanz vergeblich auf Droge Injektion unter Verwendung einer 30 G Nadel verbunden mit einem 10-cm-Polyethylen (PE 10) Katheter mit heparinisierter PBS gefüllt.
3. Nach Medianschnitt, verlängern eine Haupt-Läppchen der Leber auf der Kunststoffplatte, und platzieren Sie den Mauszeiger in Brustlage.
4. Bereiten Sie kleine Zettel mit Küche Wrap (3 mm x 8 mm) und Kachel sie um den Rand des Leberlappens zu hemmen bewegt von der Leber mit der Atmung und halten sie vor dem Austrocknen.
5. Beachten Sie die hepatischen Mikrozirkulation unter einem Mikroskop (mit Durchlicht), und bestätigen, dass die blood Flow hat keinen Stillstand im Sichtfeld für mindestens 15 min.
6. Injizieren Sie langsam 0,2 ml fluoreszenzmarkierten Erythrozyten für den Blutfluss Beobachtung oder 0,2 ml Pd-TCPP Lösung für pO _2-Messung. Dieser Betrag von FITC-markierten Erythrozyten wird für 1/50 von allen RBCs in Umlauf in der visualisierten Bereich ausmachen.

4. Blood Flow Visualization

1. Erregen die FITC durch Bestrahlung mit Quecksilberlampe Licht, das durch ein Bandpassfilter (450-490 nm) ¹ bestanden hat.
2. Datensatz das Fluoreszenzbild mit einer CCD-Kamera.

5. pO _2-Messung

Pd-TCPP Phosphoreszenz ist relativ schwach und sollte mit einem hochempfindlichen Detektor nachgewiesen werden. Alle Experimente müssen in einem dunklen Raum durchgeführt werden.

1. Die Absorptionspeaks von Pd-TCPP sind bei 410 nm und 532 nm, so dass die zweiten harmonischen Wellenlänge 532 nm für die Anregung empfohlen. YAG-Pulslaser ^2: Diese Wellenlänge kann durch einen Nd erzeugt werden.
2. Führen Sie den Strahl des Nd: YAG Laser in den entsprechenden Anschluss auf dem inversen Mikroskop, und stellen Sie den Lichtpunkt in eine zentrale Position in der Brennebene. Die räumliche Auflösung hängt von der Laserfleckgröße, die durch das Passieren des Strahls durch eine Lochblende geändert wird.
3. Um die Phosphoreszenz erkannt, angeschlossen ein Langpaßfilter (> 620 nm) und eine Photovervielfacherröhre (PMT) mit dem anderen Anschluss des Mikroskops. Die PMT sollten sensibel auf roten Wellenlängen, besonders um 700 nm liegt.
4. Probieren Sie die Phosphoreszenz-Signal (500 Punkte bei 200 kHz abgetastet) und berechnen Sie die Zeitkonstante des Zerfalls durch den Einbau einer e-Funktion, um den Zerfall.
5. Für die Kalibrierung bereiten zwei Satz von Proben mit Pd-TCPP-Lösung mit pO ₂ 150 mmHg und 0 mmHg. Fügen Natrium Dithionit 1% im Volumen zu probieren, um Abwesenheit von Sauerstoff zu produzieren. Halten Sie den pH-Wert der Proben bei 7,4 und die Temperaturtur bei 37 ° C während der Kalibrierung.
6. Befestigen Sie die Stern-Volmer-Konstante k und _q Sauerstoff-freien Lumineszenzabklingzeit τ ₀ in der Gleichung (1) ^3. In unserem Fall, in dem Pd-TCPP Lösungen bei 37 ° C und einem pH von 7,4, k _q 374 mmHg ^-1 s ^-1 und τ ₀ beträgt 0,74 ms. Diese Messung Parameter hängen von der Ausrüstung (zB Laser, Detektor, anderen optischen Geräten) und dem Signalverarbeitungsverfahren, so dass die Kalibrierung in jedem Messsystem ⁴ benötigt.
   τ ₀ / τ = ​​1 + k _q • τ ₀ • pO ₂ (1)
7. Stellen Sie die Maus auf der Platte auf dem Mikroskoptisch, beobachten Sie die hepatische Mikrozirkulation, und passen Sie die Position des Ziels microvessel bis zu dem Punkt des Laserspots.

6. Hepatitis-Modell

1. Schnelle Mäuse mit freiem Zugang zu Wasser über Nacht.
2. Bereiten Sie ein20 mg pro ml Lösung von Acetaminophen (APAP) in DMSO.
3. Injizieren Sie es intraperitoneal bei 1 ml/100 g Körpergewicht (dh 200 mg / kg KG). Nach der Injektion kann die Maus den freien Zugang zu Futter und Wasser ⁵ gegeben werden.
4. 24 Stunden nach Injektion, die Maus zu betäuben und setzen die Leber, indem eine Medianschnitt. Wenn Hepatitis erreicht wird, wird Nekrose in der Region perizentralen gut sichtbar für das bloße Auge.

7. Repräsentative Ergebnisse

Beispiel Bilder der hepatischen Mikrozirkulation in 1, wobei (a) ist eine Durchlicht-Bild und (b) ist ein Fluoreszenz-Bild zu sehen. Individuelle FITC-markierten Erythrozyten werden in der Video-Film beobachtet und Portal Venolen, Sinusoide und zentrale Blutgefäße werden durch den Blutfluss Richtungen anerkannt.

Wie in 2 gezeigt, war der Laserspot Bestrahlen einer zentralen Venole durch eine Objektivlinse x100 approximately 10 m im Durchmesser. Intravaskuläre pO ₂ in der hepatischen Mikrozirkulation wurde bei männlichen C57BL / 6 Mäusen gemessen, und Abbildung 3 (a) zeigt die Beziehungen zwischen pO ₂ und Gefäßdurchmesser in zentralen Portal und Venolen. Der pO _2-Gradienten von Portal zur zentralen Venolen zeigt an, dass Erythrozyten geben Sauerstoff effizient, während sie durch Sinusoide. Wie in Abbildung 3 (b) gezeigt, betrug die durchschnittliche _pO2 59,8 mmHg in Pfortadergefäße, 48,2 mmHg in Sinusoide, und 38,9 mmHg in zentralen Venolen.

Wenn wir eine akute Hepatitis produziert durch Einspritzen von APAP intraperitoneal, intravaskuläre pO ₂ wurde signifikant in jedem Teil der hepatischen Mikrozirkulation erhöht: p <0,05 im Pfortader-und p <0,01 in Sinusoide und zentrale Venen (Abbildung 3 (c)).

1. Schwachen Vergrößerungsmodus iEs werden Magier hepatischen Mikrozirkulation mit (a) übertragenen Lichts und (b) Fluoreszenz.

Abbildung 2. Das Bild der Laserspot Bestrahlen einer gezielten zentralen Venole für pO _2-Messung.

Abbildung 3. PO ₂ Gradienten in hepatischen Mikrozirkulation von gesunden Kontroll-Mäusen und von Mäusen mit Paracetamol-induzierten Leberschädigung. (A) zeigt pO ₂ im Vergleich zu Gefäßdurchmesser für Portal Venolen (PV) und zentralen Venolen (CV), und (b) zeigt die Sauerstoff-Gradient von PV CV über Sinusoide (S). Der pO ₂ Differenz zwischen PV und CV spiegelt den Sauerstoffverbrauch von Hepatozyten oder anderen Parenchymzellen. (C) zeigt, dass bei Hepatitis Bedingungen durch APAP Verwaltung induziert, pO ₂ deutlich wurde in PV, S und CV und der pO ₂ erhöhtGefälle verringert, was darauf hinweist, dass der Sauerstoffverbrauch der Leber beeinträchtigt wurde.

Discussion

Bereitstellung von Sauerstoff zu Geweben ist eine wesentliche Rolle der Mikrozirkulation, und eine Menge Papiere beschreiben Krankheiten im Zusammenhang mit microvessel Anatomie und Rheologie ^6. Leberdurchblutung ist eine Kombination von arteriellen und venösen Blut. Etwa 30% des Blutflusses zur Leber ist gut sauerstoffreiches Blut durch die Leberarterie und die andere 70%, durch die Pfortader vorgesehen ist, ist das schlecht sauerstoffreiches Blut venösen Abfluss aus der Milz und ^{Magen-Darm-7.} Lebererkrankungen wie Fettleber, Schock oder Tumor Veränderung der Blutfluss in der hepatischen Mikrozirkulation. Um die Sauerstoffversorgung des Gewebes zu bestimmen, muss man sowohl den Blutfluss und die Sauerstoff-Konzentration in der Mikrozirkulation zu messen. Der Mangel an kommerziell verfügbaren Instrumente für diese Prüfungen in der hepatischen Mikrozirkulation hat es schwer, physiologische Daten in diesem Bereich zu erhalten.

Ein wichtiger Punkt in der Tier-Vorbereitungsschritte ist die Fixierung vondie Leber auf einer Kunststoffplatte. Lockere Fixierung führt zu Leber-Bewegung mit der Atmung, die mit mikroskopischen Beobachtung stört und macht die Analyse schwierig synchronisiert. Straffe Fixierung bewirkt jedoch Blutfluss Stase. Der Blutfluss Bedingungen sollten aber einen Low-Power-Mikroskop während der Operation zu beachten. Hochleistungslaser leicht verletzen Mikrogefäße, so dass die Frequenz der Bestrahlung minimiert werden sollte. 1 Hz ist in der Regel genug für zeitliche Messung ^8. Allerdings dauert eine einzelne Messung des pO ₂ weniger als 1 ms, was bedeutet, dass die Wiederholfrequenz zu 1 kHz für eine rasche Änderung pO ₂ erhöht werden kann, wie nötig ist. Darüber hinaus erzeugt die photochemische Reaktion von Pd-TCPP Singulett-Sauerstoff, dass Schäden Mikrogefäßen und induziert Plättchenaggregation ^9. Die Kombination von Fluoreszenz-Imaging und pO _2-Messung kann die Durchblutung Dynamik und Sauerstoffkonzentration alle zusammen zu messen. Die Quecksilberlampe Bestrahlungspannende FITC auch reizt Pd-TCPP jedoch, wodurch viel Singulett-Sauerstoff und führt zu Stauung des Blutflusses. Wenn sowohl die Durchblutung und Sauerstoff-Partialdruck in der gleichen Tier gemessen werden, sollte die FITC Bildgebung zuvor getan Pd-TCPP wird, verabreicht werden. Darüber hinaus ist die systemische Sauerstoff-Niveau bezeichnend für die Sauerstoffaufnahme im Gewebe. Es ist vorzuziehen, die Atmungsorgane Management während der Experimente durchzuführen oder zu analysieren Blutgaswerte nach Experimenten.

Wir verwendeten APAP zu einer akuten Hepatitis induzieren, zum Teil, weil eine hohe Dosis von APAP ist bekannt, dass die Zelle Nekrose in der Region perizentralen ¹⁰ führen. Sauerstoffpartialdruck Messung zeigte die 20,9 mmHg pO _2-Differenz zwischen Portal Venolen und Venen in zentralen Kontroll-Mäusen verringerte sich auf 16,9 mmHg in der APAP-behandelten Mäusen und dass die höheren pO ₂ in der hepatischen Mikrozirkulation war. Die Sauerstoff-Gradienten in der hepatischen Mikrozirkulation ist hauptsächlich das Ergebnis von Sauerstoff supplIed Portal von Venolen in Hepatozyten verbraucht. Die höhere Dosis von APAP induziert Nekrose im Bereich perizentralen ^{11, 12,} und die sich Sauerstoffverbrauch stromabwärts abnimmt, wie in 3c gezeigt. Um detaillierte Mechanismen, die Leber Hepatitis, vor allem zwischen Gewebsnekrose und Sauerstoffgehalt, Quantifizierung über das Ausmaß der Nekrose und Serumspiegel von Bilirubin, ALT, AST, und inflammatorischen Zytokinen feststellen müssen gemessen werden. Viele Lebererkrankungen sind Beziehung zu der hepatischen Mikrozirkulation, mit anderen Worten, um den Blutfluss Verteilung, Sauerstoffversorgung und Sauerstoffverbrauch im Lebergewebe. Bei chronischen Alkoholkonsum, wird etwa 10-15% der Alkohol durch die mikrosomale Ethanol-oxidierende System metabolisiert, und der Alkohol-induzierten Molekül erzeugt P450IIE1 NAPQI ^13, einen toxischen Metaboliten, die zu perizentralen hepatischer Nekrose ¹⁴ führt.

Im Ergebnis unserer optischen measung Verfahren kann zur physiologischen und pathologischen Mechanismen durch die Analyse von mikrovaskulären Struktur, Durchmesser, Blutflussgeschwindigkeit, und Sauerstoff-Partialdruck zu untersuchen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine	Frontier Scientific, Inc.	PdT790
Fluorescein isothiocyanate isomer I	Sigma-Aldrich Co.	F7250
Acetaminophen	Sigma-Aldrich Co.	A7085
Equipment
photomultiplier tube	hamamatsu photonics k.k	H10722-20